一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，属于生物医学领域。该试剂盒包括PCR预混液、去离子水、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNase P上游引物、RNase P下游引物、TREC探针、KREC探针和RNase P探针。使用该试剂盒可以对新生儿DNA基因组中的TREC、KREC和RNase P同时进行检测，且具有性能优异、操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，从而可以为TREC和KREC相关的免疫缺陷疾病的诊断提供参考依据，以及可以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的成本效益。

A kit and method for detecting TREC and krec in neonates

【技术实现步骤摘要】
一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法
本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及新生儿免疫缺陷筛查
，特别是涉及一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法。
技术介绍
原发性免疫缺陷(PrimaryImmunodeficiency，PID)是一类罕见的免疫系统遗传病。单个基因的变异能够影响一个或者多个免疫成分，导致个体受感染的风险异常升高，通常伴随有免疫调节缺陷。重症联合免疫缺陷(SevereCombinedImmunodeficiency，SCID)是PID中最严重的一类。据报道，SCID的发病率为1/50000-1/30000。如果不进行干细胞移植，SCID是致命的，患儿通常在出生后几年死亡。对新生儿早期开展SCID筛查与诊断，从而及时实施必要的临床干预措施，能够挽救患儿的生命。因此，开发灵敏而且高特异度的SCID筛查技术和试剂盒，能够为更多的PID患儿争取最佳治疗机会，具有重要的临床意义和社会价值。T细胞受体删除环(T-cellReceptorExcisionCircle，TREC)是T细胞受体形成过程中产生的无功能的环状脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid，DNA)分子。这些DNA分子稳定地存在于T细胞内，对TREC进行定量检测，可以获得关于胸腺输出的初始T淋巴细胞数量信息，从而可对部分类型的SCID进行筛查，其特异度大于95％。由于TREC不随T细胞的分裂而复制，所以样本中TREC的拷贝数随着年龄的增长而逐步降低，因此，在新生儿早期开展TREC筛查的效果更好。与TREC类似，在B细胞的早期成熟发育过程中可产生kappa切除重组删除环(kappa-deletingrecombinationexcisioncircle，KREC)。KREC可以作为周围淋巴器官B细胞增殖的生物标志物。定量检测样本中KREC的含量，可以用于筛查一部分与B细胞发育相关的免疫缺陷。另外，实时荧光定量聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)技术基于荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，FRET)原理，实现了在PCR扩增过程中，报告基团荧光信号强度与扩增子拷贝数成比例地同步增长，从而能够对基因拷贝数进行精确定量。实时荧光定量PCR技术不仅灵敏度和特异性都相当高，而且全程闭管操作，无需开盖对PCR扩增产物进行额外的检验，从而避免了对于PCR检验实验室的潜在污染，特别适合临床检验实验室使用，是开展新生儿SCID筛查的理想技术。因此，目前急需一种基于实时荧光定量PCR技术并用于同时检测TREC和KREC含量的试剂盒及方法，以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒及方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，包括PCR预混液、去离子水、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、TREC探针和KREC探针；所述TREC上游引物和TREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示；所述KREC上游引物和KREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:4和SEQIDNo:5所示；所述TREC探针和KREC探针的寡核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:3和SEQIDNo:6所示。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的试剂盒还包括用于扩增RNaseP的RNaseP上游引物、RNaseP下游引物和RNaseP探针。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述RNaseP上游引物和RNaseP下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:7和SEQIDNo:8所示。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述RNaseP探针的寡核苷酸序列如序列表SEQIDNo:9所示。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTP、缓冲液和ROX参比荧光。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述的试剂盒还包括标准品，所述的标准品为含有TREC、KREC和RNaseP基因片段的重组质粒。本专利技术实施例提供的另一种优选方案，所述重组质粒的载体为pUC57质粒载体。本专利技术实施例还提供了一种采用上述试剂盒进行检测新生儿TREC和KREC的方法，其包括以下步骤：(1)取标准品进行稀释，得到若干组不同浓度梯度的标准品贮存液，备用；(2)采集样本，并从样本中提取DNA，得到样本基因组，备用；(3)将PCR预混液、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNaseP上游引物、RNaseP下游引物、TREC探针、KREC探针、RNaseP探针和去离子水进行混合，得到PCR反应母液，备用；(4)取上述标准品贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到标准品的PCR扩增标准曲线；(5)取上述样本基因组贮存液和PCR反应母液混合，用荧光定量PCR仪采集荧光信号，得到样本PCR扩增曲线；(6)通过荧光定量PCR仪自带的软件，计算得到样本基因组中TREC和KREC的CT值；根据CT值的大小，判断样本基因组中TREC和KREC的阴阳性。(7)与现有技术相比，本专利技术实施例的有益效果是：(1)本专利技术实施例通过提供一种含有PCR预混液、标准品、TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、RNaseP上游引物、RNaseP下游引物、TREC探针、KREC探针和RNaseP探针等的试剂盒，可以对新生儿DNA基因组中的TREC、KREC和RNaseP同时进行检测，且具有性能优异、操作简单、灵敏度高、特异性强等特点，从而可以为TREC和KREC相关的免疫缺陷疾病的诊断提供参考依据，以及可以扩大新生儿疾病筛查谱和提高新生儿免疫缺陷筛查的效益。(2)另外，对于实时荧光定量PCR技术而言，由于其高度的灵敏性，样本用量的微小差异都会明显地体现在检验结果上。为了校正由于取样量差异所造成的影响，同时为判断实时荧光定量PCR检验是否成功提供一个客观的判断依据，本专利技术实施例在检测TREC和KREC含量的同时，还对核糖核酸酶P(RibonucleaseP，RNaseP)一起进行定量检测，以作为检测TREC和KREC含量的内对照，从而可以保证检测结果更加准确和可靠。附图说明图1为实施例2得到的不同浓度梯度的标准品的PCR扩增标准曲线图(共8个标准品梯度，从左至右，浓度分别是6.7×107copies/μL、6.7×106copies/μL、6.7×105copies/μL、6.7×104copies/μL、6.7×103copies/μL、6.7×102copies/μL、6.7×101copies/μL、6.7copies/μL)图2为实施例2得到的FAM通道的样本PCR扩增曲线和NTCPCR曲线图。图3为实施例2得到的JOE通道的样本PCR扩增曲线和NTCPCR曲线图。图4为实施例2得到的CY3通道的样本PCR扩增曲线和NTCPCR曲线图。具体实施方式下面将结合本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，包括PCR预混液和去离子水，其特征在于，所述的试剂盒还包括TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、TREC探针和KREC探针；所述TREC上游引物和TREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示；所述KREC上游引物和KREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 4和SEQ ID No: 5所示；所述TREC探针和KREC探针的寡核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No: 3和SEQ ID No: 6所示。

【技术特征摘要】
2019.05.16 CN 201910405084X1.一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，包括PCR预混液和去离子水，其特征在于，所述的试剂盒还包括TREC上游引物、TREC下游引物、KREC上游引物、KREC下游引物、TREC探针和KREC探针；所述TREC上游引物和TREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示；所述KREC上游引物和KREC下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:4和SEQIDNo:5所示；所述TREC探针和KREC探针的寡核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:3和SEQIDNo:6所示。2.根据权利要求1所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于扩增RNaseP的RNaseP上游引物、RNaseP下游引物和RNaseP探针。3.根据权利要求2所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述RNaseP上游引物和RNaseP下游引物的核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo:7和SEQIDNo:8所示。4.根据权利要求3所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征在于，所述RNaseP探针的寡核苷酸序列如序列表SEQIDNo:9所示。5.根据权利要求1所述的一种检测新生儿TREC和KREC的试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓东，陈苗苗，周丽娜，王方金，赵芹，杨露，白春月，陈云弟，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，阅尔基因技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50