用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、PCR方法及其试剂盒技术

本申请属于病原微生物的检测领域，涉及用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、检测方法、和该检测方法的应用，具体地，本申请提供了一对针对科氏葡萄球菌特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列，所述PCR方法至少包括根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过Primer Premier 5设计获得所述上游引物和下游引物，所述试剂盒至少提供所述上游引物和下游引物，或者采用所述PCR方法。

PCR primers, PCR methods and kits for detection of Staphylococcus Kochi

【技术实现步骤摘要】
用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、PCR方法及其试剂盒
本申请属于病原微生物的检测领域，涉及科氏葡萄球菌的检测，尤其涉及用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物、检测方法和该检测方法的应用。具体地，本申请提供了一对针对科氏葡萄球菌特异性好、灵敏度高的检测引物、荧光定量PCR方法和检测试剂盒。
技术介绍
葡萄球菌感染是由葡萄球菌属内有致病菌作用的细菌导致的人畜共患的传染病。该属细菌广泛存在于哺乳动物的皮肤和呼吸道、上消化道、泌尿生殖道黏膜，一般经伤口侵入机体，大多会引起机体不同部位的化脓性疾病和全身败血症；此外，葡萄球菌毒素也能引起人或动物食物中毒。科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)是一种凝固酶阴性葡萄球菌，最早于1957年由Schleifer和Kloos发现，随后由德国细菌学家ferdinandCohn命名。它是一种条件致病菌，可以对人类和动物的健康以及动物养殖业等造成危害，因此引起重视。目前分离株多数来自于人类和其他猿类动物，近年来也有从其它种动物例如猪或鸭体内分离出该菌的报道。科氏葡萄球菌引起的感染的报道日益增多，主要从医院、实验动物中心、家畜养殖场等环境或动物体内分离出该菌。现有技术中，目前该菌的鉴定方法大多为细菌分离培养进行生化鉴定，同时根据细菌的形态特征、生化特性进行确定，而采用这种先培养再鉴定的方法周期长，通常至少需要4-7个工作日；对实验员的操作要求高，需要实验人员判断并识别菌落大小、形状、颜色、形态等；再者，葡萄球菌属内细菌形态特征相似不易区分等特点，因此传统的检测方法不利于早期鉴定、快速发现或控制该菌的感染。而且，该方法灵敏度低，可能存在漏检；需要结合生化鉴定结果才能确定是否存在菌株。随着生物技术的发展，分子生物学技术越来越多的应用于病原微生物的检测，现有方法中也包含PCR方法，该PCR方法是针对细菌16srDNA基因扩增并结合测序进行确定，但是目前还未出现针对科氏葡萄球菌的特异性PCR方法。所以，迫切需要一种简单、快捷且适于推广的检测方法或检测工具，以避免科氏葡萄球菌感染对人类或动物等带来的健康威胁。而荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR，qPCR)因其快速、简便、特异度强、灵敏度高等诸多优点在病原体检测领域得到广泛应用。考虑到现有技术中在葡萄球菌检测方面的不足和需求，本申请的专利技术人旨在采取SYBRGreenⅠ染料法，无需设计探针，由此可以减低成本，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，为科氏葡萄球菌的早期诊断提供依据。考虑到上述现有技术中在葡萄球菌检测方面的不足和需求，尤其是科氏葡萄球菌，本申请的专利技术人旨在采取SYBRGreenⅠ染料法，同时分析熔解曲线来评价扩增反应的特异性，无需设计探针，由此不仅减低成本，还为科氏葡萄球菌的早期诊断提供一种准确、快速、灵敏度高的检测方法。
技术实现思路
为了达到上述目的，第一方面，本申请提供了一种用于检测科氏葡萄球菌的特异性好、灵敏度高的PCR引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列。进一步地，所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得的。进一步地，所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因的保守区域设计的。进一步地，所述上游引物和所述下游引物浓度优选为20μM。进一步地，所述引物在反应体系中最终使用浓度为2μM。第二方面，本申请提供了一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，所述PCR方法至少提供一对引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列。进一步地，所述PCR方法包括以下步骤：S1、DNA提取：取待测样品提取其中的DNA，保存备用；S2、提供引物：所述根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过PrimerPremier5设计获得所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列；S3、建立PCR反应体系：所述反应体系至少包括2×PremixExTaq(SYBR)、ROX、所述上游引物、所述下游引物、分子级水、所提取的DNA模板。S4、设置PCR仪扩增反应中的参数：在荧光定量PCR反应系统中设置95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环；以及S5、采集信号，收集溶解曲线步骤。进一步地，所述PCR方法中不包括探针设计。进一步地，以所提取的DNA为模板，所述引物扩增，获得扩增片段为92bp。进一步地，所述PCR方法中Tm值为77.0℃±0.5℃，并且溶解峰单一。进一步地，所述PCR方法能够检测的目标DNA最低检测下限为250CFU/ml。第三方面，本申请提供了所述PCR引物在检测科氏葡萄球菌方面的应用。其中，所述应用至少包括一种用于检测科氏葡萄球菌的试剂盒，所述试剂盒至少提供上述上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列。进一步地，所述试剂盒还包括2×PremixExTaq(SYBR)、ROX、探针；进一步地，所述试剂盒还包括DNA模板提取试剂，或者组合DNA提取试剂盒使用。进一步地，所述试剂盒的反应体系为20μL，包含2×PremixExTaq(SYBR)10μL、ROX(50×)0.4μL、所述上下游引物(20μM)各0.2μL、分子级水4.2μL、5μLDNA模板。进一步地，所述反应体系在PCR仪中95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环。其中所述反应体系进行实时荧光定量PCR(qPCR)反应。进一步地，所述试剂盒能够检测的目标DNA浓度最小值为250CFU/ml，PCR方法检测质粒的最低检测下限为24copies/reaction。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：1、采用本申请设计的PCR引物检测科氏葡萄球菌，不仅特异性好、灵敏度高，检测时间短，而且，无需设计引物，无需对PCR扩增产物进行测序、比对，这样降低了成本，且极大地缩短检测时间，避免了采用传统检测方法繁琐、耗时、成本高等的缺点。2、由于采用本申请所述PCR引物、PCR方法及其应用针对目标DNA特异性强，灵敏度高，检测结果特异性强，不容易产生误判，相应地，检测方法及试剂盒操作步骤简单，耗时短，结果分析简单易操作，便于推广应用各种场所。附图说明图1A为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述引物进行荧光定量PCR方法的扩增曲线。图1B为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述引物进行荧光定量PCR方法的溶解曲线。图2A为根据本申请的一种实施方式采用所述一对引物进行荧光定量PCR方法的扩增曲线。图2B为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述一对引物进行荧光定量PCR方法的溶解曲线。图2C为根据本申请的一种实施方式采用本申请所述一对引物进行荧光定量PCR方法的标准曲线。具体实施方式为更清楚的了解本申请的专利技术构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图进一步解释本申请，其中关于实施方式中的技术方案本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示序列。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR引物，其特征在于：所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列。2.根据权利要求1所述的PCR引物，其特征在于：所述引物是根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得的。3.一种用于检测科氏葡萄球菌的PCR方法，其特征在于：所述PCR方法包括以下步骤：S1、DNA提取：取待测样品提取其中的DNA，保存备用；S2、提供引物：根据科氏葡萄球菌热激蛋白HSP60基因，通过引物设计软件设计获得一对引物，其包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示序列；S3、建立PCR反应体系：所述反应体系至少包括2×PremixExTaq(SYBR)、ROX、所述上游引物、所述下游引物、分子级水、所提取的DNA模板。S4、设置PCR仪扩增反应中的参数：在荧光定量PCR反应系统中设置95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火延伸34s，进行40个循环；以及S5、采集信号，收集溶解曲线步骤。4.根据权利要求3所述的PCR方法，其特征在于：所述P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立鹏，朱明星，时长军，
申请(专利权)人：苏州西山生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32