本发明专利技术公开了一种用于快速检测副溶血弧菌的试剂、试剂盒及其应用。所述检测试剂包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的第一引物、第二引物；所述第二引物对包括序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的第三引物、第四引物；所述第三引物对包括序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的第五引物、第六引物；所述第四引物对包括序列分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示第七引物、第八引物。本发明专利技术通过G‑四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，以肉眼直接观察判断待测食品中是否含有副溶血弧菌；本发明专利技术提供的检测方法具有快速、可视化、超灵敏等优点。
Reagents, kits and applications for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus
【技术实现步骤摘要】
用于快速检测副溶血弧菌的试剂、试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于检测副溶血弧菌的检测试剂、试剂盒及其应用，特别涉及一种用于早期快速检测副溶血弧菌的核酸拟酶比色检测试剂、试剂盒及其应用，属于分子生物学检测
技术介绍
食源性病原微生物引起的公共卫生问题是世界上的一大难题，其漏检率高达95％以上。根据WHO估计，全球每年因食源性微生物感染性腹泻导致的死亡人口不少于200万人，其中大部分是由于饮食和饮水受到了微生物的污染。副溶血弧菌引起的食物中毒,在细菌性食物中毒中占的比例很高,其危害仅次于沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌和肉毒梭菌。副溶血性弧菌病原菌是一种重要的肠道致病菌，为革兰氏阴性兼性嗜盐菌，世界各地均可见人类感染副溶血弧菌引起急性胃肠炎，是一种重要的食源性致病菌。副溶血弧菌分布于世界各地,通常存在于海湾和海岸线区域以及海产品中,人多因食用污染本菌又未经良好加工的海产品如蟹类、牡蛎、虾等而引起食物中毒。核酸拟酶是核酸的过氧化物酶样复合物，其通常为单链的DNA/RNA。核酸拟酶可以折叠成稳定和催化活性的G-四链体，在氯化血红素存在下与之结合可以催化一些化学反应产生颜色变化，可用于裸眼检测。将核酸拟酶结合传统PCR不仅可以避免核酸染料的污染，降低对实验器材的要求，简化传统PCR检测的操作步骤，提高检测方法的灵敏度，重要的是使检测肉眼可见也可以结合其他仪器进行定量的检测。目前,国内对于副溶血性弧菌的检测已经有了相应的国家标准和行业标准,方法大致分为以下几个过程前增菌选择性增菌选择性培养生化鉴定神奈川现象和血清学实验。检验过程需要一才能报告阳性结果。检验方法繁琐,费时费力,不仅影响检验机构的工作效率,而且使生产部门的产品运输和仓储时间延长,生产成本加大。PCR已广泛用于检测来自食品和环境样品的副溶血弧菌。最近，实时PCR因其增强的灵敏度和特异性以及快速的周转时间而越来越受欢迎。现有检测副溶血弧菌的荧光定量方法，但是使用的荧光定量PCR仪价值昂贵，使用成本高，在基层仍然不能满足监控的要求。传统的PCR仪需结合凝胶电泳的方法分析条带的大小和亮度来判断，不仅检测的灵敏度不及荧光定量PCR，且存在凝胶电泳操作步骤繁琐和实验室核酸染料的污染问题。随着传统PCR技术的普及以及便携仪器的开发，使得田间检测成为可能，但是凝胶电泳来观察结果费时费力且有一定的生物危害对实验操作者要求高，因此亟需一种基于传统PCR的便携、快速、灵敏、安全、可视化的检测方法。为了及时有效地应对未来的爆发，必须有足够的敏感，特异和可靠的方法，用于快速便捷的检测副溶血弧菌。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种能够更加灵敏、快速便捷、可视化的用于早期快速检测副溶血弧菌的核酸拟酶比色检测试剂、试剂盒及其应用，以克服现有技术中的不足。为实现前述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案包括：本专利技术实施例一方面提供了一种检测试剂，其包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示；所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物和第四引物的序列分别如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示；所述第三引物对包括第五引物和第六引物，所述第五引物和第六引物的序列分别如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示；所述第四引物对包括第七引物和第八引物，所述第七引物和第八引物的序列分别如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示。进一步的，所述第一引物、第三引物、第五引物、第七引物的5’端具有串联重复鸟嘌呤(G)且能形成核酸拟酶的互补序列。进一步的，所述的检测试剂还包括DNA聚合酶和PCR常规组件，所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液和去离子水。进一步的，所述的检测试剂还包括氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液、显色A液、显色B液和终止液。进一步的，所述氯化血红素溶液的浓度为67.5μM。进一步的，所述氯化钾溶液的浓度为500mM。进一步的，所述HEPES缓冲溶液按照25mMHepes、20mMKCl、200mMNaCl、0.025％(w/v)TritonX-100、1％(v/v)DMSO配置成50ml的试剂备用，所述HEPES缓冲溶液的pH为7.4左右。进一步的，所述显色A液，将13.6g的醋酸钠、1.6g的柠檬酸、0.05g的亚硫酸钠、30％的双氧水0.3ml、5μl的吐温20混合并定容至500ml，将配好的溶液于121℃条件下高压灭菌30min，并采用0.22μm的滤膜过滤，之后置于深色塑料瓶中于4℃条件下保存。进一步的，所述显色B液，将0.2g的EDTA二钠盐、0.95g的柠檬酸、50ml的甘油、0.05g的L-半胱氨酸盐酸盐、0.15gTMB溶于3mlDMSO中，加入ddH2O定容至500ml(所有操作要避光进行)，将配好后的显色B液置于深色玻璃瓶中并于4℃条件下保存。进一步的，显色A液和显色B液为一比一比例即时混匀使用。进一步的，所述的检测试剂还包括：二甲基亚岚、L-半胱氨酸盐酸盐、柠檬酸、浓硫酸、亚硫酸钠、甘油、过氧化氢、乙酸钠、EDTA二钠盐；其主要用于提高显色试剂的稳定性以及显色效果的灵敏度。本专利技术实施例还提供了一种试剂盒，其包括所述的检测试剂。本专利技术实施例还提供了一种应用于副溶血弧菌检测方法的产品，所述产品包括所述检测试剂或所述试剂盒，并且，所述检测方法包括：利用所述第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对，通过PCR扩增反应从待测样品内对提取到的核酸进行扩增；将PCR扩增后的产物与氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液混合形成第一混合体系，加热解链后恒温孵育；将孵育后的第一混合体系与所述显色A液和显色B液混合形成第二混合体系，并通过观察第二混合体系的颜色或检测第二混合体系的OD值实现对待测样品内副溶血弧菌的定性或定量检测。进一步的，所述PCR扩增反应的反应体系为：TaqDNAPolymerase(5U/μl)1.25μL，10×TaqBuffer5μL，dNTPMix(10mmol/L)1μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，上游引物(10uM)2μL，下游引物(10uM)2μL，样品模板2μL，补足32.75μLddH2O至总体积为50μL。进一步的，所述PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，扩增30个循环，充分延伸72℃5min。进一步的，所述检测方法包括：将所述第一混合体系于98℃左右条件下加热解链，之后于37℃恒温孵育。与现有技术相比，本专利技术的优点包括：1)本专利技术通过G-四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，能够以肉眼直接同时判断待测食品中是否含有副溶血弧菌；本专利技术提供的检测方法具有快速、可视化、超灵敏等优点，并且，对于提高食源性致病菌的检测灵敏度、降低成本和便捷性的实现具有重要意义,对于在实验环境较为不足的实验室进行普及或开展副溶血弧菌的快速检测有巨大帮助；2)本专利技术提供的检测方法，无需复杂操作、无需大型仪器设备、灵敏度高、便捷、高效、低成本,不仅能够解决目前在广大基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测试剂，其特征在于包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物和第四引物的序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示；所述第三引物对包括第五引物和第六引物，所述第五引物和第六引物的序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示；所述第四引物对包括第七引物和第八引物，所述第七引物和第八引物的序列分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测试剂，其特征在于包括第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对；所述第一引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQIDNO：1、SEQIDNO：2所示；所述第二引物对包括第三引物和第四引物，所述第三引物和第四引物的序列分别如SEQIDNO：3、SEQIDNO：4所示；所述第三引物对包括第五引物和第六引物，所述第五引物和第六引物的序列分别如SEQIDNO：5、SEQIDNO：6所示；所述第四引物对包括第七引物和第八引物，所述第七引物和第八引物的序列分别如SEQIDNO：7、SEQIDNO：8所示。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述第一引物、第三引物、第五引物、第七引物的5’端具有串联重复鸟嘌呤(G)且能形成核酸拟酶的互补序列。3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括DNA聚合酶和PCR常规组件。4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于还包括氯化血红素溶液、氯化钾溶液、HEPES缓冲溶液、显色A液、显色B液和终止液。5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于：所述HEPES缓冲溶液包含25mMHepes、20mMKCl、200mMNaCl、0.025％(w/v)TritonX-100、1％(v/v)DMSO，所述HEPES缓冲溶液的pH为7.4左右；和/或，所述显色A液包含醋酸钠、柠...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛峰，陈诗胜，任建鸾，戴建君，陈伟，蒋原，苏静，曾德新，汤芳，郭德华，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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