用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测肺炎链球菌的引物组。所述引物组包括分别针对肺炎链球菌DNA目的片断和内标的特异性引物及探针。本发明专利技术还涉及一种用于检测肺炎链球菌的试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液、酶混合物、阴性对照品和阳性对照品，所述PCR反应液包括检测肺炎链球菌DNA目的片断和内标的特异性引物及探针。本发明专利技术提供的试剂盒及其检测方法具有操作简单、检测时间短、检测敏感性高及特异性好等优点，特别适合在临床检验工作中普及应用。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒
本专利技术涉及体外诊断
，尤其涉及一种用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，sp)为革兰染色阳性球菌，多呈双排列或短链排列。有荚膜，其毒力大小与荚膜中的多糖结构及含量有关。根据荚膜多糖的抗原特性，可分为86个血清型。成人致病菌多属1-9型及12型，以第3型毒力最强，儿童则多6,14,19以及23型。机体免疫功能正常时，肺炎链球菌是寄居在口腔及鼻咽部的一种正常菌群，带菌率随年龄，季节及免状态的变化有差异。机体免疫功能受损时，有毒力的肺炎链球菌入侵人体而致病。肺炎链球菌肺炎是由肺炎链球菌感染所引起的肺炎，约占社区获得性肺炎的半数。通常急骤起病，以高热，寒战，咳嗽，血痰及胸痛为特征。SP除引起肺炎外，少数可发生菌血症或感染性休克，老年人及婴幼儿的病情尤为严重。现有技术中对肺炎链球菌的快速检测方法如下：1、传统的培养方法(国标法)，即从血液或胸腔积液培养分离获得SP仍然作为诊断的金标准；2、乳胶凝集法，该法是一种针对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法；3、自动化方法，目前微生物检测的自动化仪器已普通使用，对于肺炎链球菌检测常见方法有：APE20Streep鉴定试条、VITEKMAS系统、PHOENIXMIC/ID鉴定板和MICRO-SANWalkAway等；4、免疫层析法(Immunochromatograhy，ICT—，目前广泛用于SP诊断的快速方法，其检测为SP各血清型所共有的抗原C多糖。该方法可用于检测尿液、胸腔积液、脑脊液和支气管灌洗液；5、核酸扩增技术，PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)属于一种核酸体外扩增技术，靠寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，并采用凝胶或探针杂交检测扩增的DNA。但上述的方法中仍然存在不足之处，采用传统的培养方法(国标法)、乳胶凝集法和免疫层析法检测，会出现假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性；自动化方法由于自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性，而且目前尚无一个能包括所有细节鉴定资料的鉴定系统；而核酸扩增技术(PCR)虽然结果好于上述4种方法，但是PCR扩增产物需要进行后处理，而PCR产物后处理存在污染，仍会导致假阳性结果，并且会对环境造成污染，对实验人员有潜在的危害。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测肺炎链球菌的引物组和试剂盒，具有操作快速、方法简单、检测灵敏度高、特异度强和准确度好的优点。本专利技术提供一种用于检测肺炎链球菌的引物组，所述引物组包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-GGCTGCTGGAACATCGATAC-3’下游引物：5’-ACAGCGCTACAGTCAATGTC-3’探针：5’-FAM-TGTCCTTAACGTTGTCTGCAACGGC-TAMRA-3’内标上游引物:5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’内标下游引物:5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’内标探针:5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。本专利技术还提供一种用于检测肺炎链球菌的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-GGCTGCTGGAACATCGATAC-3’下游引物：5’-ACAGCGCTACAGTCAATGTC-3’探针：5’-FAM-TGTCCTTAACGTTGTCTGCAACGGC-TAMRA-3’内标上游引物:5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’内标下游引物:5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’内标探针:5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。在本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述PCR反应液中各引物的终浓度为0.4μmol/L，各探针的终浓度为0.125μmol/L。在本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括酶混合物，所述酶混合物为热启动酶和UNG酶的混合液。在本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。在本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述阳性对照品为肺炎链球菌标准菌株悬液中提取的基因组DNA，所述阴性对照品为生理盐水。在本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的试剂盒一较佳实施例中，所述试剂盒还包括内标，所述内标的核苷酸序列如下：TCACAAGCAGGAGTGTGCCAGGAGAAGGCCAAACCATCCAGTGCCGGTGGTTTGACCACGAGGAGTGCATCCTGCACGGAGTCACTGAGCTCGTGACCTCCACGCTGCTCGTCCCCTGCGCTATCGAGAGGGCACTCTCTGTGTCTCAGCTGGTGCCGCTGGCGCAGAGTGTTTTGGGCCCCTTAAAGCTCAGCATGGCTGGTTCTGGAGAGATGGAAAAGAGAAAGGATTTCCCCCATTTGGGTGCCTCGGGCATGTGGAGGAAGGTGGTCCGGCGAACGAAGCAGGGCTGCGTGAAGGGGATCTGATAACCCACGTCAACGGAGAGCCAGTCCATGG。本专利技术还提供一种如上文所述的引物组在制备检测肺炎链球菌的试剂盒中的用途。相较于现有技术，本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌的引物组及试剂盒有益效果在于：一、本专利技术提供的试剂盒操作快速、方法简单、检测灵敏度高，特异度100％，应用该试剂盒可对未知样本中的肺炎链球菌进行快速准确的检测，为诊断肺炎链球菌感染提供可靠的实验依据，特别适合在临床检验工作中普及应用。二、PCR反应液中包括针对肺炎链球菌设计的特异性引物、探针及针对内标的特异性引物及探针，基于内标具有表达稳定的优点，可以有效避免假阴性的发生，且还能较好地对目的基因表达量进行校正，从而提高本专利技术方法的灵敏度和重复性，使得检测结果更加准确可靠。附图说明图1为本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌试剂盒中阴性对照品的PCR扩增曲线图；图2为本专利技术提供的用于检测肺炎链球菌试剂盒中阳性对照品的PCR扩增曲线图；图3为临床样本的PCR扩增曲线图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1：引物和探针的设计与合成在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载Streptococcuspneumoniae的参照序列(GenBank:NC_003098.1,序列全长2038615bp)，并使用免费开源的kers工具Jellyfish(https://github.com/gmarcais/Jellyfish)对全基因组序列进行连续切割，挨个碱基划动得到的序列长度为80到250的核苷酸序列库，从中优选重复较多(>＝2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测肺炎链球菌的引物组，其特征在于，包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’‑GGCTGCTGGAACATCGATAC‑3’下游引物：5’‑ACAGCGCTACAGTCAATGTC‑3’探针：5’‑FAM‑TGTCCTTAACGTTGTCTGCAACGGC‑TAMRA‑3’内标上游引物:5’‑GGCATGTGGAGGAAGGTGGT‑3’内标下游引物:5’‑CCATGGACTGGCTCTCCGTT‑3’内标探针:5’‑HEX‑ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG‑TAMRA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肺炎链球菌的引物组，其特征在于，包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-GGCTGCTGGAACATCGATAC-3’下游引物：5’-ACAGCGCTACAGTCAATGTC-3’探针：5’-FAM-TGTCCTTAACGTTGTCTGCAACGGC-TAMRA-3’内标上游引物:5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’内标下游引物:5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’内标探针:5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。2.一种用于检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括如以下核苷酸序列所示的引物及探针：上游引物：5’-GGCTGCTGGAACATCGATAC-3’下游引物：5’-ACAGCGCTACAGTCAATGTC-3’探针：5’-FAM-TGTCCTTAACGTTGTCTGCAACGGC-TAMRA-3’内标上游引物:5’-GGCATGTGGAGGAAGGTGGT-3’内标下游引物:5’-CCATGGACTGGCTCTCCGTT-3’内标探针:5’-HEX-ACGCAGCCCTGCTTCGTTCGCCG-TAMRA-3’。3.根据权利要求2所述的用于检测肺炎链球菌的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液中各引物的终浓度为0.4μmol/L，各探针的终浓度为0.125μmol/L。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：马东礼，邢志浩，刘孝荣，姜含芳，朱纯青，
申请(专利权)人：马东礼，
类型：发明
国别省市：广东,44