肺炎链球菌及其中的荚膜多糖合成方法和SPD-0064基因编码产物及该编码产物的用途技术

本专利公开了医药生物技术领域中的肺炎链球菌，包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。荚膜多糖生成抑制基因存在部分缺失、序列点突变或缺失的一种或多种改变会影响SPD‑0064基因或其编码产物功能和活性，来实现干扰或抑制SPD‑0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇的启动子区的结合，从而干扰或破坏荚膜多糖基因簇转录功能，最终增加荚膜多糖产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药生物
，具体涉及肺炎链球菌及其中的荚膜多糖合成方法和肺炎链球菌的中间产物及该中间产物的运用。
技术介绍
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pn），为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜，并将该多糖称之为荚膜多糖（capsule，CPS），荚膜多糖是革兰阳性细菌表面普遍存在的一种多糖聚合物，通过共价结合的方式固定于细胞壁外层肽聚糖上，目前已经鉴定出的肺炎链球菌荚膜多糖有98种；再根据荚膜多糖抗原性的不同，可将肺炎链球菌分为84种血清型菌株。肺炎链球菌血清型菌株通常寄居在人类鼻咽的粘膜表面，当机体免疫力低下时，可从鼻咽部粘膜的寄居处非侵袭地持续扩散至肺部引起肺炎、至血液引起败血症、至脑脊液引起脑膜炎或其他的部位引起疾病（中耳炎、鼻窦炎、气管炎）。其病理表现主要是最初肺泡内有大量纤维蛋白渗出液，继之是红细胞和白细胞向肺泡内渗出，最终导致病变部位肺组织实变。肺炎链球菌感染是全球儿童和成人致病和致死的主要原因之一，全球每年因肺炎链球菌感染死亡的总人数大致与结核相仿，高达300至500万人，其中5岁以下儿童每年发病率高达100万，死亡率高达11%。20世纪80年代中期，青霉素耐药肺炎链球菌已在全球广泛报道，尽管在不同国家、地区差异较大，但从总体来看，近年来由于抗生素的广泛应用，肺炎链球菌的耐药率呈迅速上升趋势。在我国，耐红霉素肺炎链球菌几乎为100%，肺炎链球菌对其一线药物青霉素的耐药率也超过40%，甚至还出现了耐万古霉素的肺炎链球菌，这些都使得肺炎链球菌引起的疾病在治疗上面临巨大问题。接种肺炎链球菌疫苗预防感染是目前较为有效的防治措施，荚膜多糖可诱导宿主产生特异性的抗体，能有效抵御同型血清细菌感染；目前市售的23价荚膜多糖疫苗和13价多糖结合疫苗均以荚膜多糖为基础，现已广泛使用。已知肺炎链球菌CPS的生物合成主要由荚膜多糖基因簇决定，基因簇各基因的表达受上游序列（约200bp）调控。SPD-0064（亦称capsular polysaccharide repressor，cpsR）基因——见附图13，属于细菌GntR型转录因子家族成员；总体而言，GntR型转录因子包含一个N-末端的HTH（helix-turn-helix）DNA结合域和C-末端的效应结合域；整个GntR型转录因子其DNA结合域在结构上高度保守，其亚家族分类依赖于DNA结合域之外的多变区域；在大多数革兰阳性菌，GntR型转录因子参与糖代谢调控，为葡萄糖酸操纵子转录抑制因子；已知肺炎链球菌GntR型转录因子之一与纤维二糖代谢相关，具有负性调控作用。目前常规的肺炎链球菌的制备方法中用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源的葡萄糖的浓度均低于3mmol/L，造成碳源不足而引起肺炎链球菌的生长缓慢，导致荚膜多糖的产量少。而市售的肺炎链球菌疫苗在生产上均要用到荚膜多糖，荚膜多糖生产直接影响到疫苗的生产成本；因此，本领域迫切需要提高荚膜多糖产量，降低疫苗成本。
技术实现思路
本专利技术意在提供肺炎链球菌，以解决现有技术中的荚膜多糖产量低的问题。本方案中的肺炎链球菌，包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。所述荚膜多糖生成抑制基因是SPD-0064基因或SPD-0064基因的等位基因或同源基因。所述SPD-0064基因的等位基因或同源基因与SPD-0064基因全长或功能结构域编码序列同源性大于30%。所述荚膜多糖生成抑制基因为SPD-0064基因。本方案的有益效果：荚膜多糖生成抑制基因存在部分缺失、序列点突变或缺失的一种或多种改变会影响SPD-0064基因或其编码产物的功能和活性，来实现干扰或抑制SPD-0064编码产物与荚膜多糖基因簇启动子区的结合，从而干扰或破坏荚膜多糖基因簇转录功能，最终增加荚膜多糖产量。本专利技术另一个目的是提供合成产量高的荚膜多糖的合成方法。使用的培养基中添加有用于干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥的葡萄糖、小分子抑制剂或单克隆抗体或干扰SPD-0064基因表达的RNA中的一种或多种。使用的培养基为各类用于肺炎链球菌培养的培养基，在培养基中再次添加葡糖糖溶液形成增强型培养基，使得增强型培养基中的葡萄糖浓度大于等于5mmol/L。目前常规的肺炎链球菌的制备方法中用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源的葡萄糖的浓度均低于3mmol/L，使用的培养基为各类用于培养肺炎链球菌的培养基，在申请中使用的培养基为C+Y培养基，为一种市场售卖常用于真菌培养的培养基，主要含有葡萄糖、淀粉等营养物质，该葡萄糖含量浓度低于3mmol/L；在C+Y培养基中再次添加葡糖糖溶液形成增强型C+Y培养基，使得增强型C+Y培养基中的葡萄糖浓度大于等于5mmol/L。用于提供肺炎链球菌生长所需的碳源，及用于干扰GntR型转录因子SPD-0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇起始密码子上游200 bp的DNA结合，从而促进肺炎链球菌荚膜多糖的转录与合成。使用的培养基中添加有用于干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥的葡萄糖、小分子抑制剂、单克隆抗体或干扰SPD-0064基因表达的RNA中的一种或多种；干扰或影响SPD-0064基因或其编码产物的功能或活性的发挥，以提高荚膜多糖的含量。本专利技术再一个目的得到SPD-0064基因改变后的SPD-0064基因编码产物，在利用SPD-0064基因编码产物来增强肺炎链球菌感染的检测效果。SPD-0064基因编码产物为存在部分缺失、序列点突变、序列点缺失其中一种情形的荚膜多糖生成抑制基因所表达生成的蛋白质。SPD-0064基因编码产物，用于肺炎链球菌感染的检测应用。传统检测是通过对肺炎链球菌血清型菌株的数量来完成，而肺炎链球菌血清型菌株的数量庞大，并且其中部分肺炎链球菌血清型菌株不会引起病疫，导致检测受到干扰，造成检测效果不佳；本申请是通过加入SPD-0064基因或其编码产物，由SPD-0064基因或其编码产物与能引起病疫的肺炎链球菌血清型菌株反应，SPD-0064基因突变或其编码产物表达减少或SPD-0064基因编码产物与荚膜多糖基因簇启动子区结合位点结合能力减弱，直接检测SPD-0064基因或其编码产物则能得到精准的能引起病疫的肺炎链球菌血清型菌株数量或精准的判断肺炎链球菌感染性疾病的严重程度，使得检测更加精确。附图说明图1：荚膜多糖启动子上游临近区域DNA序列图；图2：SPD-0064基因编码产物结合位点DNA序列图；图3：SPD-0064 up-erm-SPD-0064 down连接PCR(聚合酶链式反应）结果图；图4：肺炎链球菌D39野生菌血平板生长菌落形态图；图5：肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌血平板生长菌落形态图；图6：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌cps基因mRNA转录水平（qRT-PCR检测）比较图；图7：肺炎链球菌D39野生菌、肺炎链球菌D39ΔSPD-0064缺陷菌和肺炎链球菌过表达菌CPS表达水平（斑点杂交法本文档来自技高网...

【技术保护点】
肺炎链球菌，其特征在于：包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。

【技术特征摘要】
1.肺炎链球菌，其特征在于：包括肺炎链球菌血清型菌株，所述肺炎链球菌血清型菌株中存在整体缺失、部分缺失、序列点突变或序列点缺失的一种或多种的荚膜多糖生成抑制基因。2.根据权利要求1所述的肺炎链球菌，其特征在于：所述荚膜多糖生成抑制基因是SPD-0064基因或SPD-0064基因的等位基因或同源基因。3.根据权利要求2所述的肺炎链球菌，其特征在于：所述SPD-0064基因的等位基因或同源基因与SPD-0064基因全长或功能结构域编码序列同源性大于30%。4.根据权利要求2所述的肺炎链球菌，其特征在于：所述荚膜多糖生成抑制基因为SPD-0064基因。5.根据权利要求2所述的SPD-0064基因编码产物，其特征在于：该编码产物为...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴凯峰，尹一兵，张雪梅，徐红梅，
申请(专利权)人：遵义医学院第三附属医院，
类型：发明
国别省市：贵州;52