一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。本发明专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒包括：一组以白喉棒状杆菌的调节基因DtxR基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针；一组以白喉棒状杆菌的毒力基因Tox基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针。本发明专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒不仅可以检测白喉棒状杆菌，而且可以同时检测此菌株是否携带Tox毒力基因，因此在疫情防控工作中对于菌株和疫情的判定具有重要的作用。

A fluorescent PCR kit for detection of Corynebacterium diphtheriae

The invention discloses a fluorescent PCR kit for detecting Corynebacterium diphtheriae. The fluorescent PCR kit for detecting Corynebacterium diphtheriae includes: a group of forward primers, reverse primers and fluorescent probes designed with the regulatory gene DtxR of Corynebacterium diphtheriae as the target gene; a group of forward primers, reverse primers and fluorescent probes designed with the virulence gene tox gene of Corynebacterium diphtheriae as the target gene. The fluorescent PCR kit for detecting Corynebacterium diphtheriae of the invention can not only detect Corynebacterium diphtheriae, but also detect whether the strain carries tox virulence gene at the same time. Therefore, it plays an important role in the determination of strain and epidemic situation in epidemic prevention and control work.

【技术实现步骤摘要】
一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒
本专利技术属于生物医药
，涉及一种荧光PCR检测试剂盒，具体涉及一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。
技术介绍
白喉棒状杆菌是一种革兰染色阳性、菌体一段或两端膨大呈棒状，并可通过呼吸道传播从而导致人类白喉的急性传染病病原体。该病原体常侵犯的部位为咽、喉、气管和鼻腔黏膜，也可侵犯眼结膜、皮肤黏膜。感染后的典型特征为鼻、咽喉等处黏膜充血、肿胀并形成灰白色假膜，导致呼吸障碍。外毒素进入血液引起全身中毒症状，严重者可导致心肌炎或末梢神经麻痹。在全球范围内尽管白喉疫苗已经广泛覆盖，但是据世界卫生组织统计在上世界90年代，前苏联有15.7万人感染并导致约5000人死亡。2014年全球仍有7321例白喉病例，并且病例主要集中在发展中国家。近年来在我国周边的印度、老挝和泰国均有爆发。我国在十九世纪的50年代、60年代，每年新发病例上万人，发病率高达10/10万-20/10万。但自1962年卫生部发布《预防接种工作实施办法》以来尤其是1978年后，白喉发病率和死亡率快速下降，70年代降至约3/10万，80年代低至1/10万，90年代低于0.01/10万。据国家卫生部传染病统计信息及文献报道，在2000年后至今仅有个别病例报道。但在2010年在一肿瘤患者的眼角分离了一例不带Tox毒力基因的白喉棒状杆菌。越来越多的不含毒力的白喉杆菌造成症状不典型的疾病如心内膜炎、化脓性关节炎、或者在不常见的位置造成感染。白喉毒素是一种强毒性，强抗原性的蛋白质，是由β棒状杆菌噬菌体侵袭无毒性白喉杆菌，其Tox基因整合宿主染色体而成为产毒性白喉杆菌。白喉毒素有A、B两个肽链组成，A肽链是白喉毒素毒性功能区，抑制易感细胞蛋白质的合成；B肽链有一个受体结合区和转位区，本身无毒性但能协助A肽链进入易感细胞内。DtxR是白喉毒素抑制蛋白，广泛存在于产毒和不产毒菌株中，通过金属依赖的方式调节白喉杆菌产生白喉毒素。DtxR蛋白是白喉杆菌代谢的全面调节因子，不但调节白喉毒素的表达，也负责调节铁载体和其他7种启动子的合成。由于目前主流的检测试剂盒均是针对有毒力的白喉棒状杆菌，而不含毒力基因的白喉棒状杆菌常会被错误的判定为阴性而导致判断失误。例如，江苏和创生物科技有限公司申请的“白喉棒状杆菌荧光PCR检测试剂盒”(申请号：201610019376.6)所采用的是针对白喉棒状杆菌毒力基因(Tox基因)的引物。因此，有必要开发全面检测白喉棒状杆菌的试剂盒，避免漏检，以用于疾病预防和疫情控制。需要一种快速并且可以同时检测其特征基因和毒力基因的检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒。本专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒包括：一组以白喉棒状杆菌的调节基因DtxR基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针；一组以白喉棒状杆菌的毒力基因Tox基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针。根据本专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒的进一步特征，所述以DtxR基因为靶基因设计的正向引物的序列为SEQIDNO.1，反向引物的序列为SEQIDNO.2，荧光探针的序列为SEQIDNO.3。优选地，所述荧光探针的荧光报告基团是FAM，非荧光淬灭基团为BHQ1。根据本专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒的进一步特征，所述以Tox基因为靶基因设计的正向引物的序列为SEQIDNO.4，反向引物的序列为SEQIDNO.5，荧光探针的序列为SEQIDNO.6。优选地，所述荧光探针的的荧光报告基团是HEX，非荧光淬灭基团为BHQ1。本专利技术所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒不仅可以检测白喉棒状杆菌，而且可以同时检测此菌株是否携带Tox毒力基因，因此在疫情防控工作中对于菌株和疫情的判定具有重要的作用。首先，本试剂盒检测的为白喉棒状杆菌DtxR基因，此基因为白喉毒素抑制蛋白基因。白喉毒素抑制蛋白广泛存在于白喉棒状杆菌产毒株和不产毒株，通过金属依赖的方式调节白喉棒状杆菌产生白喉毒素。DtxR基因(GeneID：29421139)全长681bp，高度保守，因此本试剂盒的FAM荧光可以检测是否有dtxR基因而确定是否为白喉棒状杆菌。其次，本试剂盒可同时通过HEX荧光检测白喉棒状杆菌的Tox毒力基因。白喉棒状杆菌通过Tox基因表达白喉外毒素，外毒素与敏感细胞结合而进入到细胞内，抑制胞内蛋白质合成，并导致细胞内颗粒物增加，继之细胞聚集、脱落。从而引起人体咽喉等部位粘膜充血、肿胀并出现白色假膜并导致人体出现发热、咳嗽、吸入性呼吸困难等急性上呼吸感染症状，严重者可出现心肌炎、神经麻痹等。Tox毒素是菌株主要的致病物质，不含有Tox基因的菌株毒力弱，因此对Tox毒力基因的鉴定可以推测菌株是否具有高毒力。传统的细菌培养方法是细菌鉴定的金标准，白喉棒状杆菌的培养需要特殊的培养基吕氏血清斜面或亚碲酸钾培养基；白喉棒状杆菌产生的外毒素是其主要的致病因素，只有携带了β-棒状杆菌噬菌体才能产生外毒素。通常使用下列两种方法检测其外毒素：艾立克平板毒力实验和豚鼠皮内接种毒力实验。艾立克平板毒力实验需要使用白喉抗毒素，培养时间为72小时；豚鼠皮内接种毒力实验需要两只豚鼠和白喉抗毒素，需要72小时后观察接种部位异常情况。这两种毒力实验方法操作均较为复杂。本专利技术所述的试剂盒采用双重荧光PCR技术可以同时检测白喉棒状杆菌及其毒力基因，只需将采取的鼻咽拭子样本提取核酸后，使用本试剂盒即可在1小时判断是否为白喉棒状杆菌及是否含有毒力基因。本专利技术所述的试剂盒灵敏度高，特异性强，操作简单，成本低廉，检测时间快速。附图说明图1是本专利技术所述的试剂盒检测白喉杆菌DtxR基因的灵敏度检测曲线。图2是本专利技术所述的试剂盒检测白喉杆菌Tox基因的灵敏度检测曲线。具体实施方式以下通过具体实施例并结合附图对本专利技术进行详细说明。1.引物设计选择白喉棒状杆菌的调节基因DtxR基因和毒力基因Tox基因作为靶基因设计引物和探针(见表1)。表1：DtxR基因和Tox基因的引物及探针序列注：DtxR基因的扩增片段长度为129bp，Tox基因的扩增片段长度为133bp。DtxR基因的荧光探针优选为：FAM-CGATACCACAGAGATGTACTTGCG-BHQ1。Tox基因的荧光探针优选为：HEX-TACCGACAATAAATACGACGCTGC-BHQ12.DNA模板制备将采集的鼻咽拭子标本混匀后取100μl到1.5ml离心管中，加入50μl裂解液，100℃恒温加热10min，12000rpm离心2min，上清液即为制备的模板。也可使用商品化DNA提取试剂盒提样品DNA。3.荧光PCR反应体系和扩增程序每个样本反应体系为：反应液20μl，待测样本DNA5μl。检测通道为FAM和HEX，淬灭通道为none。PCR循环参数设置为：95℃10min；95℃5sec，55℃30sec，40个循环，在55℃时采集荧光。在检测样品时，需同时做阳性对照和阴性对照。4.结果判断FAM通道和HEX通道的Ct值均≤35，且有指数增长曲线，则白喉棒状杆菌和毒力基因均为阳性。FAM通道和HEX通道Ct值均＞35，且有指数增长曲线，则结果为可疑，需要重复实验。FA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：一组以白喉棒状杆菌的调节基因DtxR基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针；一组以白喉棒状杆菌的毒力基因Tox基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒，其特征在于，包括：一组以白喉棒状杆菌的调节基因DtxR基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针；一组以白喉棒状杆菌的毒力基因Tox基因为靶基因设计的正向引物、反向引物和荧光探针。2.根据权利要求1所述的检测白喉棒状杆菌的荧光PCR试剂盒，其特征在于：所述以DtxR基因为靶基因设计的正向引物的序列为SEQIDNO.1，反向引物的序列为SEQIDNO.2，荧光探针的序列为SEQIDNO.3。3.根据权利要求2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯水平，吴新伟，张周斌，杨智聪，
申请(专利权)人：广州市疾病预防控制中心广州市卫生检验中心，
类型：发明
国别省市：广东,44