基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用。该引物上游序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示，探针如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术通过特殊引物和探针设计，进行鸡毒支原体(MG)检测，具有更高的灵敏度和特异性，可排除假阳性、操作简便，方便快捷，实现了现场直接检测，应用前景广泛。

Primers, probes, kits and their applications for detection of Mycoplasma gallisepticum (mg) based on RPA

The invention relates to the field of molecular biology technology, in particular to a primer, probe, kit and application for detecting mycoplasma gallisepticum (mg) based on RPA technology. The upstream sequence of the primer is as shown in SEQ ID No.1, the downstream sequence is as shown in SEQ ID No.2, and the probe is as shown in SEQ ID No.3. Through the design of special primers and probes, the invention can detect Mycoplasma gallisepticum (mg), which has higher sensitivity and specificity, can eliminate false positive, is easy to operate, convenient and fast, realizes direct detection on site, and has a wide application prospect.

【技术实现步骤摘要】
基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用。
技术介绍
鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)又称禽霉形体，主要导致鸡慢性呼吸道疾病(Chronicrespiratorydisease,CRD)。MG在禽体内潜伏6d-21d后，感染鸡通常表现的症状是气管锣音、咳嗽、流鼻涕、流眼泪，一侧或两眼睑肿胀或粘合。雏鸡表现为生长迟缓、发育不良、病弱雏增多，淘汰率增加；蛋鸡多表现为产蛋下降，这种产蛋率下降通常会维持在一个低的产蛋水平上，会持续几十天至几个月不发生变化，因不象其它疾病引起的产蛋率下降那样突然和明显，往往会被养鸡人员所忽视。通常情况下，其产蛋率会下降10％左右，严重时可达20-30％。对肉鸡来说，由于生长迟缓，造成上市时间迟，生产效率下降。如果没有并发感染其它疾病，一般死亡率不高，病理剖检上主要表现为鼻窦炎、结膜炎和肺炎的病理变化；如伴有其它病毒性和细菌性疾病，特别是伴有大肠杆菌感染时，表现为严重的肝周炎和心包炎的变化，死亡率也较高。随着养鸡规模加大、饲养方式改变和饲养密度提高，该病发病率越来越高，主要影响雏鸡生长、使成年鸡产蛋减少，造成养鸡业经济上的重大损失，危害性日益突出，受到养鸡业者的普遍关注。因此，加强鸡毒支原体(MG)的监测和研究具有重要的现实意义。尽早准确检测MG直接影响着家禽健康与经济效益，关系到我国现代化家禽业发展。目前MG的检测常采用血清学方法，如ELISA、血清平板凝集(SPA)、病原分离培养和PCR方法作为确证方法，但该方法灵敏度低，存在交叉反应，培养周期长或样品易污染等方面不足。随着分子生物学技术的发展，应用较多病毒检测方法有聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR和荧光定量PCR等技术。但PCR技术本身存在反应时间久，成本高、时效性低，对实验环境要求高、操作复杂繁琐、并且需要具有一定分子生物学基础及操作技术的专业人员才能完成，不能满足家禽养殖现场检测诊断的需求。恒温检测技术不但摆脱了变温仪，而且在保证检测结果准确的前提下，极大的缩短了反应时间。RPA(recombinasepolymeraseamplification)等温扩增技术被公认是可以替代PCR的核酸检测技术。其原理利用重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。另外，在37-42℃间，20分钟内就可以对含有靶标序列的样品进行扩增,扩增效率远远高于传统的PCR技术。由于RPA技术具有扩增用时短、不需要昂贵仪器、特异性好等特点，使其应用越来越广泛。采用RPA进行鸡毒支原体(MG)的专一检测的技术目前尚未见报道，要获得灵敏度及专一性强的特殊引物，在RPA技术进行设计的基础上，还需要考虑引物长度及特异性探针序列。
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物、探针、试剂盒及其应用；该引物和探针具有高度的特异性和专一性，扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，正向引物如SEQIDNO.1所示，反向引物如SEQIDNO.2所示，探针如SEQIDNO.3所示；上游引物QF：5'-TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAAT-3'(SEQIDNO.1)；下游引物QR:5'-TGAGGTAATAACTTAATGAAGTCATTAGTTGCTCT-3'(SEQIDNO.2)；探针QP：5'-AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATATCTGTAAATTGAATTA-3'(SEQIDNO.3)。探针序列中荧光报告基团(FAM)、荧光淬灭基团(BHQ1)、四氢呋喃位点(THF)的磷酸基团(phosphate)的具体位置如下：AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATA(FAM-dT)T(THF)C(BHQ1-dT)TGTAAATTGAATTA(phosphate)。一种含有所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物的试剂盒。所述试剂盒包括酶混合液、ddH2O、再水化缓冲液。所述酶混合液包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶。所述试剂盒还包括鸡毒支原体(MG)阳性对照品DNA和280mM醋酸镁溶液。所述的试剂盒在检测鸡毒支原体(MG)中的应用。一种检测鸡毒支原体(MG)的方法，包括如下操作步骤：(1)引物组和探针合成：合成权利要求1或2中的引物和探针；(2)提取鸡毒支原体(MG)的DNA；(3)采用含有步骤(1)的引物和探针的RPA扩增体系，进行RPA扩增反应及实时荧光检测；(4)设立阳性对照和空白对照，若得到明显的扩增曲线，表明检出鸡毒支原体(MG)。步骤(3)的RPA扩增体系以20μl计，包括：RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂18μL，280mM的醋酸镁(MgAc)溶液1μL，模板DNA1μL。所述RPA-鸡毒支原体(MG)检测试剂包含：再水化缓冲液(Buffer)11.8μL，10μM上下游引物各0.55μL，探针0.25μL，酶混合液4μL，ddH2O0.85μL。8、根据权利要求5所述的方法，其特征在于，RPA扩增反应的扩增条件为37℃-42℃、扩增反应15-20min。上述RPA扩增反应在实时荧光检测仪中进行。本专利技术的有益效果:本专利技术相比现有LAMP法、qPCR技术，对温度要求低，在37-42℃的等温条件下即可进行，检测时间短，检测效率高。通过将RPA技术与荧光探针结合，可以直接从反映出来的荧光信号值判断结果，直观可靠。本专利技术通过特殊引物和探针设计，进行鸡毒支原体(MG)检测，具有更高的灵敏度和特异性，可排除假阳性、操作简便，方便快捷，实现了现场直接检测，应用前景广泛。本专利技术检测方法用于鸡发病前期及病害预测预防，对于确定防治期、有效防病治病具有重要意义。附图说明图1为本专利技术鸡毒支原体(MG)RPA特异性扩增曲线图；图2为本专利技术鸡毒支原体(MG)RPA检测灵敏度扩增曲线图。图3为本专利技术鸡毒支原体(MG)RPA的4条探针的对此优化扩增曲线图。具体实施方式为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本专利技术进行详细阐述。若未特别指明，以下实时例均照常规实验条件进行操作，实时例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中使用RPA试剂盒为Basic试剂盒，购置英国TwistDXInc公司；其中，能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶是以冻干粉状态存在于试剂盒所提供的RPA反应管中，使用时直接用试剂盒所带的反应缓冲液稀释。整个RPA反应过程在RPA反应管中进行。实施例1：引物和探针的合成RPA反应工作原理：在RPA反应中，需要三种酶的参与，分别是重组酶、单链结合蛋白以及DNA聚合酶。在RP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，其特征在于，引物和探针的核苷酸序列为：上游引物QF：5'‑TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAAT‑3'(SEQ ID NO.1)；下游引物QR：5'‑TGAGGTAATAACTTAATGAAGTCATTAGTTGCTCT‑3'(SEQ ID NO.2)；探针QP：5'‑AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATATCTGTAAATTGAATTA‑3'(SEQ ID NO.3)。

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，其特征在于，引物和探针的核苷酸序列为：上游引物QF：5'-TATTCCATCATCATTCTTTGAAAACAAAAT-3'(SEQIDNO.1)；下游引物QR：5'-TGAGGTAATAACTTAATGAAGTCATTAGTTGCTCT-3'(SEQIDNO.2)；探针QP：5'-AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATATCTGTAAATTGAATTA-3'(SEQIDNO.3)。2.根据权利要求1所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针组合物，其特征在于，探针序列中荧光报告基团(FAM)、荧光淬灭基团(BHQ1)、四氢呋喃位点(THF)的磷酸基团(phosphate)的具体位置如下：AATATCAGGATTGTTTTGAGGTGGAGTATA(FAM-dT)T(THF)C(BHQ1-dT)TGTAAATTGAATTA(phosphate)。3.一种含有权利要求1或2所述的基于RPA技术检测鸡毒支原体(MG)的引物和探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋玲玲，亓丽红，艾武，刘涛，鞠艳，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37