一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法，包括以下步骤：(1)血液中肺炎链球菌基因组DNA的提取；(2)PCR检测：a、利用肺炎链球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，正向引物如SEQ ID NO.1所示；反向引物如SEQ ID NO.2所示；引物的扩增片段长度为293bp；b、以从血液中提取的肺炎链球菌基因组DNA为模板，采用特异PCR引物进行PCR扩增；c、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为293bp的片段则判定为检测出肺炎链球菌。本发明专利技术对血液中肺炎链球菌的检测极限达到10CFU/mL，临床应用的灵敏度高。

A method to detect the pathogenic bacteria of Streptococcus pneumoniae from clinical blood

The invention provides a method for detecting the pathogenic bacteria of Streptococcus pneumoniae from clinical blood, which comprises the following steps: (1) extraction of genomic DNA of Streptococcus pneumoniae in blood; (2) PCR detection: A. design a specific PCR primer by using the genomic DNA sequence of Streptococcus pneumoniae, the forward primer is as shown in SEQ ID No.1; the reverse primer is as shown in SEQ ID No.2; the amplified fragment length of the primer is as follows: For 293bp, B, the genomic DNA of Streptococcus pneumoniae extracted from blood was used as template, specific PCR primers were used to amplify PCR. C, PCR amplified products were agarose gel electrophoresis and detection, and the amplified 293bp fragment was identified as Streptococcus pneumoniae. The detection limit of the invention for Streptococcus pneumoniae in blood reaches 10 CFU / ml, and the sensitivity of clinical application is high.

【技术实现步骤摘要】
一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法
本专利技术涉及血液感染病原菌的检测
，具体涉及一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法。
技术介绍
血流感染引起的菌血症和败血症的临床病死率高，且它的发病率也有升高的态势。肺炎链球菌作为一种革兰氏阳性菌，其导致的临床肺炎链球菌感染严重者会出现菌血症肺炎等多种并发症。目前，针对临床血液中肺炎链球菌感染的检测，医院“金标准”的检验方法是传统的细菌培养方法。传统检测过程需经过长时间的菌培养过程，此外还包括转种分离、革兰染色镜检以及药敏生化分析等一系列复杂的检测程序。这种院内传统的检测方法不仅费时费力，而且对于那些难培养或培养不出来的临床致病菌的检测往往会出现假阴性的状况。所以，建立一种快速高效的血样中肺炎链球菌感染的检测方法具有重要的临床意义。本专利技术通过对临床血液中肺炎链球菌基因组DNA的有效提取和对其特异基因的PCR扩增检测，实现对血液中肺炎链球菌感染的快速有效诊断。
技术实现思路
本专利技术为了克服医院临床血液中肺炎链球菌感染检测传统培养方法的检测周期长和检测效率低等技术问题，本专利技术公开了一种简单快速、特异和高效的从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法。本专利技术首先简单快速地提取出血样中肺炎链球菌的基因组DNA；再利用待测肺炎链球菌的特异基因设计特异性PCR扩增引物，通过PCR反应快速高效地检测出临床血液中肺炎链球菌感染。为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法，包括以下步骤：(1)血液中肺炎链球菌基因组DNA的提取；(2)血液中肺炎链球菌PCR检测：a、利用肺炎链球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物如SEQIDNO.1所示：5’-GCTTGGATGTTCGTGGTA-3’；所述反向引物如SEQIDNO.2所示：5’-GATTTCTGGGTGCTCTGC-3’；引物的扩增片段长度为293bp；b、以步骤(1)中从血液中提取的肺炎链球菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；c、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为293bp的片段则判定为检测出肺炎链球菌。本专利技术步骤(1)中，血液样品中肺炎链球菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：a、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；b、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；c、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；d、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；e、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；f、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMTris-HCl(pH8.0)混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；g、重复步骤f1次；h、空DNA吸附柱12000转/分钟离心5分钟，并将DNA吸附柱转移至1.5mL离心管内；i、向空DNA吸附柱膜中央加入30μL10mMTris-HCl和1mMEDTA混合液，pH为8.0-8.5；12000转/分钟离心2分钟，收集洗脱下来的基因组DNA。优选地，步骤(1)的步骤a中，酶裂解液中含有：0.1mg/mL核糖核酸酶A、1mg/mL蛋白酶K、0.05mg/mL广谱裂解酶、10mg/mL溶菌酶、25mMTris-HCl、10mMEDTA，pH8.0-8.5。优选地，步骤(1)的步骤b中，碱裂解液中含有：0.2MNaOH，1％SDS，pH12-14。优选地，步骤(1)的步骤c中，去杂液中含有：4MNH4Ac-HAc，pH4.5-4.8。本专利技术步骤(2)的步骤(b)中，PCR扩增时PCR的反应体系为：2倍FlashHotStartMasterMix5μL，2μmol/L的正向引物1μL，2μmol/L的反向引物1μL，基因组DNA模板1μL，双蒸水补足至10μL。PCR的反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸5s，30次循环；最后72℃延伸7min，16℃保存。优选地，步骤(2)中，提供肺炎链球菌基因组DNA提取的菌含量≥10CFU/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术技术方案突破临床传统血液病原菌检测方法的局限，研发和建立了一种快速高效的血液中肺炎链球菌感染的检测方法。此专利技术方法可以成功检测出临床血液样品中的肺炎链球菌。第一，本专利技术方法简单快速。本专利技术仅通过基因组DNA提取试剂盒和PCR扩增检测方法，无需传统检测方法的复杂繁琐的培养步骤，而且将传统的临床检测周期3-6天缩短至4-6h左右，大大提高了检测的时效性。第二，本专利技术方法特异性和灵敏度高。本专利技术设计的PCR扩增引物特异性高，仅扩增出肺炎链球菌的特异基因。而且本专利技术对血液中肺炎链球菌的检测极限达到10CFU/mL，临床应用的灵敏度高。本专利技术所建立的PCR检测方法简单快速、检测效率高，可以对临床血液样品中肺炎链球菌感染实现快速高效的早期诊断，在血液样品中肺炎链球菌感染的临床及时诊断和治疗以及指导医师用药中具有重要的临床应用价值。该专利技术方法具有操作简单方便，检测速度快，特异性高，灵敏度高，稳定性强等显著优势。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中的所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为肺炎链球菌引物的特异性实验结果；其中，1：Marker(100bp)；2：肺炎链球菌；3：单增生李斯特菌；4：绿脓杆菌；5：金黄色葡萄球菌；6：大肠埃希菌；7：肺炎克雷伯菌；8：阴性对照。图2为血液中肺炎链球菌检测的灵敏度实验结果；其中，1：阴性对照；2：阴性血样；3-11：分别为107，106，105，104，103，102，10，1，108CFU/mL菌量的肺炎链球菌；12：Marker(100bp)。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)血液中肺炎链球菌基因组DNA的提取；/n(2)血液中肺炎链球菌PCR检测：/na、利用肺炎链球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；/n所述正向引物如SEQ ID NO.1所示：5’-GCTTGGATGTTCGTGGTA-3’；/n所述反向引物如SEQ ID NO.2所示：5’-GATTTCTGGGTGCTCTGC-3’；/n引物的扩增片段长度为293bp；/nb、以步骤(1)中从血液中提取的肺炎链球菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；/nc、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为293bp的片段则判定为检测出肺炎链球菌。/n

【技术特征摘要】
1.一种从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液中肺炎链球菌基因组DNA的提取；
(2)血液中肺炎链球菌PCR检测：
a、利用肺炎链球菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，所述PCR引物包括正向引物和反向引物；
所述正向引物如SEQIDNO.1所示：5’-GCTTGGATGTTCGTGGTA-3’；
所述反向引物如SEQIDNO.2所示：5’-GATTTCTGGGTGCTCTGC-3’；
引物的扩增片段长度为293bp；
b、以步骤(1)中从血液中提取的肺炎链球菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；
c、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为293bp的片段则判定为检测出肺炎链球菌。


2.根据权利要求1所述的从临床血液中检测肺炎链球菌病原菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，血液样品中肺炎链球菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：
a、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；
b、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；
c、步骤S1.2中裂解处理后的血液样品与去杂液体按积比为2：1混合，加入去杂液后立即混匀直至出现沉淀，放置离心机中室温12000转/分钟离心10分钟；
d、轻轻吸取上层悬液至DNA吸附柱中，并将DNA吸附柱套在2mL离心管内；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
e、向DNA吸附柱内加入500μL的0.4MKI与异丙醇混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附柱；
f、再向DNA吸附柱内加入700μL的80％v/v无水乙醇和10mMpH8.0的Tris-HCl混合液；12000转/分钟离心1分钟，去除离心管内的废液，将2mL离心管重新套入DNA吸附...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敬，王旭，孙宝林，郭建，吴谨，
申请(专利权)人：卓源健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34