一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法，属于生物技术领域。所述方法包括以下步骤：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物；设计目标微生物类群与目标微生物的特征区域；设计特征区域的多重扩增引物；在待测样品中加入参考微生物与外源核酸后，提取待测样品中的微生物的核酸；利用设计的多重引物扩增微生物核酸，扩增获得特征测序片段；利用特征测序片段定性、定量分析待测样品中微生物。本发明专利技术不需要对微生物进行预培养与增殖，可以一次性地对待测样品中的多种已知微生物进行高通量、高准确度、高分辨率的检测，检测过程简单、快速且流程规范。

A method of qualitative and quantitative detection of intestinal microorganisms for non diagnostic purposes

The invention discloses a qualitative and quantitative detection method of intestinal microorganism for non diagnostic purposes, belonging to the field of biotechnology. The method comprises the following steps: determining the target microorganism group, target microorganism and non target organism in the sample to be tested, and the reference microorganism which does not exist in the sample to be tested; designing the characteristic area of the target microorganism group and target microorganism; designing the multiple amplification primers of the characteristic area; adding the reference microorganism and exogenous nucleic acid in the sample to be tested, and extracting The nucleic acid of the microorganism in the sample to be tested; the nucleic acid of the microorganism is amplified by the designed multiple primers to obtain the characteristic sequencing fragment; the microorganism in the sample to be tested is qualitatively and quantitatively analyzed by the characteristic sequencing fragment. The invention does not need pre culture and proliferation of microorganisms, and can detect a variety of known microorganisms in the test sample at one time with high flux, high accuracy and high resolution, and the detection process is simple, fast and standard.

【技术实现步骤摘要】
一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法。
技术介绍
肠道微生物是肠道疾病诊断的重要依据，肠道微生物精确地定性与定量检测是十分必要的。现有肠道微生物定性与定量检测技术包括形态学计数、芯片检测、16SrRNA测序、宏基因组测序和实时定量PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)。形态学计数检测需要对微生物进行预培养，耗时长，不可培养微生物不可检测，一次仅能够检测一种微生物，通量低，在计数时抽样量有限，且结果粗糙，无法对种以下的分类单元进行区分。芯片检测所需的待测样品的DNA量大，需要对微生物进行预培养及富集处理，检测结果不准确，且无法做定量检测。16SrRNA测序无法对种以下的分类单元进行区分。宏基因组测序深度有限，对于低含量的微生物的定量检测准确度很差。实时定量PCR一次只能检测一种微生物，通量低。另外，已有方法共有缺陷是，无法计算微生物定性与定量的可靠性，使得结论实用性差。以上技术缺陷导致了肠道疾病诊断不及时、诊断不准确以及误诊等问题。
技术实现思路
为了解决现有技术中微生物定性与定量检测不准确的问题，本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法。所述技术方案如下：本专利技术实施例提供了一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法，所述方法包括：确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为粪便或肠道组织；根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；提取所述混合样品的核酸；利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析。具体地，所述目标微生物类群的数目≥1个，且每个所述目标微生物类群包括≥0种所述目标微生物；所述目标微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生动物中的至少一种；所述参考微生物为细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、支原体、衣原体、螺旋体和原生动物中的至少一种。具体地，所述确定待测样品中的非目标生物的方法包括：将所述非目标生物确定为除所述目标微生物类群之外的所有生物，若能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指除所述目标微生物类群之外的所有生物；若不能获得所述目标微生物类群的特征区域，则所述非目标生物指所述混合样品中，除所述目标微生物类群之外的其它生物。具体地，所述目标微生物类群的特征区域为所述目标微生物类群内的微生物的参考基因组上的核酸序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述参考基因组中为单一序列；所述目标微生物类群的特征区域的两侧的序列在所述目标微生物类群内不同微生物间保守；所述目标微生物类群的特征区域的区分度≥3；所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群的特征区域同源；所述目标微生物的特征区域的m2值≥2，其中，m2值为所述目标微生物的特征区域与所述目标微生物类群内除所述目标微生物外的其它所述微生物间的差异碱基数的最小值；所述参考微生物的特征区域为所述参考微生物的参考基因组上的核酸序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在所述参考微生物的参考基因组中为单一序列；所述参考微生物的特征区域的两侧的序列在除所述参考微生物外的其它生物中不具有同源性。进一步地，所述区分度是指由同一所述混合多重扩增引物扩增的任一所述目标微生物类群的特征区域与任一非特征区域间的差异碱基数的最小值，其中，所述非特征区域是所述混合多重扩增引物以所述混合样品的核酸为模板的扩增产物，且所述非特征区域不为所述目标微生物类群的特征区域，若无所述非特征区域，则所述区分度＝3×L1/4，其中，L1为所述目标微生物类群的特征区域的核酸序列长度。具体地，在提取所述混合样品的核酸时，若所述待测样品中核酸的含量过低，则在提取所述混合样品的核酸的过程中，加入所述混合多重扩增引物不能扩增的外源核酸。具体地，所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α1和α3为判断阈值；n2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：/n确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为粪便或肠道组织；/n根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；/n制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；/n向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；/n提取所述混合样品的核酸；/n利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；/n利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；/n根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析；/n所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：/n将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；/n将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；/n将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；/n若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；/n若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；/nn1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α1和α3为判断阈值；/nn2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P4为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α2和α4为判断阈值；/nP5＝1-BINOM.DIST(S1,S1,P1,FALSE)，P6＝1-BINOM.DIST(S3,S3,P2,FALSE)，S1为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量的中位数；S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数量的中位数，FALSE为参数值；BINOM.DIST函数返回一元二项式分布的概率；/n所述目标微生物类群和所述目标微生物的定量分析方法如下：/n所述目标微生物类群的量M1＝Mr×S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信区间为[M11，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物的量；S2为所有的所述参考微生物的特征区域的所述参考微生物的特征测序片段的数量的中位数；M11和M12分别为M1值的置信区间的下限与上限；/n所述目标微生物的量M2＝M1×S3/S1，所述目标微生物的量的置信区间为[M21，M22]，M21和M22分别为M2值的置信区间的下限与上限；/nM11＝M1×(1-S4/S1)，M12＝M1×(1+S5/S1)，M21＝M2×(1-S6/S3)，M22＝M2×(1+S7/S3)；其中，S4...

【技术特征摘要】
1.一种非诊断目的的肠道微生物定性与定量的检测方法，其特征在于，所述方法包括：
确定待测样品中的目标微生物类群、目标微生物和非目标生物、以及不存在于所述待测样品中的参考微生物，所述待测样品为粪便或肠道组织；
根据所述目标微生物类群、所述目标微生物、所述参考微生物和所述非目标生物的参考基因组序列，获得所述目标微生物类群的特征区域、所述目标微生物的特征区域和所述参考微生物的特征区域；
制备扩增所述目标微生物类群的特征区域的第一多重扩增引物、扩增所述目标微生物的特征区域的第二多重扩增引物和扩增所述参考微生物的特征区域的第三多重扩增引物，将所述第一多重扩增引物、所述第二多重扩增引物和所述第三多重扩增引物混合得到混合多重扩增引物；
向所述待测样品中加入所述参考微生物，获得混合样品；
提取所述混合样品的核酸；
利用所述混合多重扩增引物和所述混合样品的核酸进行扩增反应，获得扩增产物；
利用所述扩增产物进行高通量测序，获得高通量测序片段；
根据所述高通量测序片段，对所述目标微生物类群和所述目标微生物进行定性和定量分析；
所述目标微生物类群和所述目标微生物的定性分析方法如下：
将所述高通量测序片段与每种所述目标微生物类群的特征区域进行比对，当差异碱基数≤n1时，则比对成功，相应的所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征区域，其中，n1为所述目标微生物类群的特征测序片段的最大容错碱基数；若比对成功的所述目标微生物类群的特征区域≥1种时，则判断所述高通量测序片段为所述目标微生物类群的特征测序片段；
将所述目标微生物的特征区域与每种同源的所述目标微生物类群的特征区域进行比对，在所述目标微生物的特征区域中提取差异碱基组成所述目标微生物的标准基因型；在所述目标微生物类群的特征测序片段上，提取所述目标微生物的标准基因型所对应的碱基，组成所述目标微生物的测试基因型；若所述目标微生物的测试基因型与所述目标微生物的标准基因型的差异碱基数≤n2，其中，n2为所述目标微生物的特征测序片段的最大容错碱基数，则所述目标微生物的测试基因型所在的所述高通量测序片段为所述目标微生物的特征测序片段；
将所述参考微生物作为仅包含一个所述目标微生物的所述目标微生物类群，计算获得的所述目标微生物的特征测序片段，即为所述参考微生物的特征测序片段；
若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5≥α5，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物类群，其中，α5为概率保障；若所述目标微生物类群的特征测序片段存在的概率P5<α5，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物类群；
若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6≥α6，则判断所述待测样品中存在所述目标微生物，其中，α6为概率保障；若所述目标微生物的特征测序片段存在的概率P6<α6，则判断所述待测样品中不存在所述目标微生物；
n1使得P1≤α1且P3≤α3，其中，P1为一条不是所述目标微生物类群的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P3为一条所述目标微生物类群的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物类群的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α1和α3为判断阈值；
n2使得P2≤α2且P4≤α4，其中，P2为一条不是所述目标微生物的特征测序片段的所述高通量测序片段被误判为所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阳性的概率；P4为一条所述目标微生物的特征测序片段被误判为不是所述目标微生物的特征测序片段而产生的假阴性的概率；α2和α4为判断阈值；
P5＝1-BINOM.DIST(S1,S1,P1,FALSE)，P6＝1-BINOM.DIST(S3,S3,P2,FALSE)，S1为所有的所述目标微生物类群的特征区域的所述目标微生物类群的特征测序片段的数量的中位数；S3为所有的所述目标微生物的特征区域的所述目标微生物的特征测序片段的数量的中位数，FALSE为参数值；BINOM.DIST函数返回一元二项式分布的概率；
所述目标微生物类群和所述目标微生物的定量分析方法如下：
所述目标微生物类群的量M1＝Mr×S1/S2，所述目标微生物类群的量的置信区间为[M11，M12]，其中，Mr为加入所述待测样品中的所述参考微生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖俊松，曹雁平，李秀婷，吴华，卢龙，彭海，许朵霞，袁英髦，王少甲，赵晓丹，章伟雄，任圣，张静，
申请(专利权)人：北京工商大学，江汉大学，
类型：发明
国别省市：北京;11