RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得番茄RGS1基因编辑的突变体，发现该突变体不仅能够显著增强对番茄细菌性叶斑病的抗性，而且能够显著减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的发生程度，证明了RGS1基因作为负调控因子在减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病病害发生中的用途，可用于抗寡照环境下细菌性叶斑病品种的选育。

The application of RGS1 gene as a negative regulator in improving bacterial leaf spot resistance of Tomato under low illumination

The invention discloses the application of RGS1 gene as a negative regulatory factor in improving the bacterial leaf spot resistance of Tomato under the environment of oligo illumination. The nucleotide sequence of the protein coding region of RGS1 gene is shown in SEQ ID No.1. The application way is to improve the bacterial leaf spot resistance of tomato mutant under the environment of oligo illumination by knocking out RGS1 gene. The invention obtains tomato RGS1 gene editing mutant by CRISPR / cas9 gene editing technology. It is found that the mutant can not only significantly enhance the resistance to bacterial leaf spot disease of tomato, but also significantly reduce the occurrence degree of bacterial leaf spot disease of Tomato under low light environment, which proves that RGS1 gene, as a negative regulatory factor, can reduce the occurrence of bacterial leaf spot disease of Tomato under low light environment The utility model can be used for the breeding of bacterial leaf spot under the environment of low light resistance.

【技术实现步骤摘要】
RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用。
技术介绍
我国蔬菜播种面积在2000年到2015年经历了一个迅速增长的阶段，近几年依旧有缓慢增长的趋势，但基本保持稳定。目前，蔬菜已成为我国市场化程度最大的经济作物。2018年中国统计年鉴数据显示，在农作物种植结构中蔬菜的种植比例由2000年的9.75％上升到2017年的12.0％，居各类经济作物之首(http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2018/indexch.htm)。其中，番茄因其营养丰富，口感鲜美，广受喜爱。同时，番茄也是设施栽培的主要蔬菜之一。随着大气环境不断变化以及农业种植方式的设施化，雾霾和连续阴雨等不适宜天气状况及设施遮阴等带来的寡照问题日益严重。番茄是喜光植物，当光照强度低于150umolm-2s-1时，番茄植株易徒长，开花数减少。尤其在寡照环境下，番茄病害爆发严重，各种细菌性、病毒性以及真菌性病害频繁发生，十分猖獗。寡照和病害的共同危害，加之单一的种植模式，对设施栽培番茄产量及品质造成了极大的威胁。细菌性叶斑病是其中一种高发病害，由丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000)引发的，是一种革兰氏阴性细菌。这种病菌对番茄的危害主要表现在叶片上，也可发生在叶脉和果实，影响番茄的果实品质和产量。寡照环境下番茄细菌性叶斑病的爆发更为严重，给农户造成了更大的经济损失。一方面，我国主要使用化学农药防治细菌性叶斑病仍为最常见的手段。虽然化学农药防治具有使用方法简便、效率高、见效快的优点，但是也存在着严重的问题：一、长期使用某一种类的农药会使有害生物产生一定的抗性，防治效果逐渐下降；二、大量的化学农药投入严重破坏了农业生态平衡，一些害虫天敌因为农药影响而数量减少，以及有害生物可能产生一定抗性，很有可能出现有害生物再猖獗的情况；三、农药的使用不仅影响环境生态，残留的化学农药也会引发食品安全问题，对人们的身体健康造成威胁。另一方面，在寡照环境下，可通过补光的措施来提高光照强度，减轻病害。但补光需要搭建设备，会消耗大量的人力、物力、资金。而且一般更针对设施蔬菜栽培，不适合大范围的露地栽培中寡照问题的解决，譬如露地栽培中遇到连续降雨天气，或是秋冬季普遍光照强度低等，小范围、短时间的补光难以从根本上解决日益严重的寡照问题。综合上述两方面的考虑，寻找出新的、有效的、生态绿色、经济无害的方法，有效提高番茄应对寡照等不良环境下病害频发的能力，是目前蔬菜生产中亟待解决的难题之一，也是当今蔬菜生产和科研工作中的研究热点。而培育能够增强寡照等环境下对番茄病害抵抗性的抗性品种则是一个很好的解决方法，具有重要的实际生产意义。近年来CRISPR/Cas9基因编辑技术得到了迅速的发展，相比于传统育种，该技术能够精准敲除基因组中的任何基因，从而精确的改变农作物性状，快速获得理想种质，大大缩短育种时间。并且利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行育种可以不引入外源基因，规避了颇有争议的转基因技术。利用该技术，可以将一些作物本身负调控病害的基因精准敲除，创建、培育抗性品种。因此，寻找作物内负调控病害的基因就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术提供了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的新用途，为培育提高作物抗性，尤其是减轻寡照环境下细菌性叶斑病发生程度的番茄品种提供依据。具体技术方案如下：本专利技术提供了RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的新用途，所述RGS1基因的全基因DNA序列如SEQIDNO.2所示，蛋白编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其蛋白编码区长度为1434bp；所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。该RGS1基因编码的蛋白调控G蛋白的信号，由477个氨基酸组成，其序列如SEQIDNO.3所示。在正常光照环境下，植物通过光合作用形成蔗糖等碳水化合物，经过韧皮部运输至细胞间隙，即质外体区域。在该区域通过蔗糖酶分解成葡萄糖和果糖。细胞膜上的RGS1基因可以感知质外体葡萄糖，发生胞吞(endocytosis)，使得RGS1蛋白与G蛋白α亚基GPA1互作减弱，引起下游G蛋白的激活，从而增强植物对细菌性叶斑病的抗性。而经试验发现，在寡照环境下，外界光强减弱，植物的光合作用减弱，导致番茄质外体葡萄糖含量显著减少；RGS1基因编码的RGS1蛋白通过感知质外体葡萄糖信号发生胞吞的程度减少，细胞膜上的RGS1蛋白依然与G蛋白α亚基GPA1互作，导致不能激活下游的G蛋白信号途径介导的抗病反应过程。本专利技术建立在上述试验现象的基础上，采用基因编辑技术使RGS1基因突变，引发G蛋白处于激活状态，进而增强植物对细菌性叶斑病的抗性。本专利技术首先对番茄RGS1(基因编号：Solyc05g014160，PGSB网站http://pgsb.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/)进行序列分析，查找PAM序列，将NGG前的20个bp的序列定义为sgRNA，选择定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgRNA序列，该特异性靶向RGS1基因蛋白编码区的sgRNA的DNA序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术通过基因编辑技术和组培技术，构建了RGS1基因CRISPR/Cas9载体，并筛选获得了遗传稳定并且不含外源Cas9蛋白的纯合突变体株系rgs1#1。通过在正常光和寡照环境下接种番茄细菌性叶斑病病原菌，统计发病率，发现rgs1#1植株能够显著减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病病害的发生程度。进一步地，所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述光照强度＜150umolm-2s-1，即光照强度＞0umolm-2s-1且＜150umolm-2s-1。此外，本专利技术还通过液相HPLC的方法，发现将番茄植株置于寡照环境6小时后，番茄叶片质外体葡萄糖含量显著降低；并通过构建35S:RGS1-GFP的农杆菌载体，利用该载体的农杆菌菌液注射烟草后，提取原生质体观察其亚细胞定位，发现RGS1基因定位于细胞膜上(图4a)。本专利技术还提供了一种减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，包括：(1)培育寡照环境下抗番茄细菌性叶斑病的番茄突变体；(1-a)在番茄RGS1基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以其前20个碱基为依据，设计相应引物，构建CRISPR/Cas9载体；(1-b)构建含步骤(1-a)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；(1-c)用步骤(1-b)所述基因工程菌转化番茄子叶，获得遗传稳定并且不含外源Cas9蛋白的突变体；(2)用步骤(1)所述的番茄突变体替换寡照环境下种植的野生型番茄，所述寡照环境为光照强度明显本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。/n

【技术特征摘要】
1.RGS1基因作为负调控因子在提高寡照环境下番茄细菌性叶斑病抗性中的应用，其特征在于，所述RGS1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述应用的途径为通过敲除RGS1基因使寡照环境下番茄突变体的细菌性叶斑病抗性得到提高。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述寡照环境为光照强度明显弱于番茄适宜生长所需光强的环境，所述光照强度＜150umolm-2s-1。


3.一种减轻寡照环境下番茄细菌性叶斑病的方法，其特征在于，包括：
(1)培育寡照环境下抗番茄细菌性叶斑病的番茄突变体；
(1-a)在番茄RGS1基因的蛋白编码区选取含有PAM结构的靶标片段，以其前20个碱基为依据，设计相应引物，构建CRISPR/Cas9载体；
(1-b)构建含...

【专利技术属性】
技术研发人员：师恺，王娇，马巧梅，胡璋健，王萍，王安然，李依镁，喻景权，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33