一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统技术方案

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。所述基因编辑载体系统包括分别含有大麦条纹花叶病毒RNAα、RNAβ和RNAγ的人造质粒；在RNAβ或RNAγ中，整合有所需的sgRNA序列。本发明专利技术基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统可以对本生烟等双子叶植物和小麦、玉米等单子叶植物的基因组进行高效的基因编辑。

A gene editing vector system based on barley stripe mosaic virus

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a gene editing carrier system based on barley stripe mosaic virus. The gene editing vector system includes artificial plasmids containing barley stripe mosaic virus RNA \u03b1, RNA \u03b2 and RNA \u03b3 respectively; in RNA \u03b2 or RNA \u03b3, the required sgRNA sequence is integrated. The gene editing vector system based on barley streak mosaic virus can efficiently edit the genomes of dicotyledons such as Bensheng tobacco and monocotyledons such as wheat and corn.

【技术实现步骤摘要】
一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。
技术介绍
基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑操作，对靶标基因的编辑效率与靶标细胞中Cas9蛋白和sgRNA的表达量息息相关。通常，基于瞬时表达载体的基因编辑载体可以通过基因枪导入植物组织当中，也可以通过农杆菌介导的转化导入植物当中。但是由于瞬时表达载体本身并不能在靶标细胞中复制和转移，从而最终能够获得sgRNA和Cas9蛋白的细胞的数目是有限的，获得Cas9蛋白和sgRNA的细胞中，二者的含量也是有限的，从而对基因编辑的效率会产生不利的影响。为此，往往需要同时转化大量的受体组织，进行较大规模的组织培养操作才可能筛选出目标突变体，因而相当费时费力，成本较高。相对而言，基于植物病毒的基因编辑载体由于其可以高效复制，从而可以有较提高靶标细胞中sgRNA和/或Cas9蛋白的含量；此外，某些基于植物病毒的基因编辑载体在宿主植物中仍可以保持系统运动的能力，从而使能够获得sgRNA和/或Cas9蛋白的细胞比例大大增加进而有利于提升对靶标基因的编辑效率。同时，基于植物病毒的基因编辑载体在操作上也较为简单，通过农杆菌浸润或者摩擦接种的方式即可侵染宿主植物，从而实现对宿主植物内源基因进行基因编辑的目的。目前报道的基于植物病毒的基因编辑载体主要包括植物双生病毒，烟草脆裂病毒(Tobaccorattlevirus，TRV)和烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)等，它们各自均具有一些重要优点，但也同时存在一些不足之处。植物双生病毒为DNA病毒，在侵染植物时，双生病毒可能与宿主细胞竞争复制、翻译等相关因子，干扰植物正常生长，同时也给植物组培再生带来困难。基于双生病毒复制子的基因编辑载体往往无法在植物中进行运动和扩散。此外，双生病毒目前仍然是对农作物威胁最为严重的病毒种类之一，可以引发严重的症状，对作物造成巨大的破坏，且双生病毒可以经由昆虫(例如烟粉虱)进行传播，一旦扩散，难以控制。2016年报道了基于RNA病毒TRV的基因编辑载体。TRV的基因组包含两条单链RNA，虽然基于TRV的基因编辑载体保持了系统运动的能力，但是TRV的寄主范围较为有限，其一般并不侵染包括大麦，小麦，玉米等重要作物在内的单子叶植物，从而限制了其在这些重要的农作物上的应用。2017年报道了基于TMV的基因编辑载体。但是由于其在设计时，去除了病毒本身的运动蛋白，使病毒丧失了系统运动的能力，因而其得以发挥作用的部位较为有限。此外，TMV同样不能侵染小麦，玉米等禾本科作物。因此，急需开发一种可应用单子叶禾本科作物(例如小麦)的基因编辑载体，并保留病毒在宿主植物中的系统运动能力和复制能力。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种基于大麦条纹花叶病毒(BSMV)的基因编辑载体系统。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供了一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统。所述大麦条纹花叶病毒的为多分体RNA病毒，基因组包含三条正义、单链基因组RNA，分别称为RNAα(GenBank：U35767.1)，RNAβ(GenBank：U35770.1)和RNAγ(GenBank：U13917.1)。其中RNAα编码的αa蛋白和RNAγ编码的γa蛋白构成病毒的复制酶；RNAβ编码病毒的外壳蛋白CP和三联体运动蛋白TGBs；RNAγ还编码一个小蛋白γb，它是一个多功能的蛋白。当RNAα，RNAβ，RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制和运动；当仅有RNAα和RNAγ同时存在时，病毒可以在适当的环境下在宿主植物中复制。BSMV可以侵染包括大麦，小麦，玉米，谷子等在内的多种单子叶植物以及双子叶植物本生烟。需要说明的是，当所述基因编辑载体系统需要应用于玉米的基因编辑时，所述RNAβ为在野生型大麦条纹花叶病毒RNAβ(GenBank：U35770.1)的基础上发生突变的β链，所述突变导致RNAβ编码的TGB1蛋白的第404位由氨基酸G(甘氨酸)突变为E(谷氨酸)，相关突变信息可参考胡悦博士学位论文(大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白磷酸化修饰在病毒侵染和运动中的功能分析，胡悦，中国农业大学博士学位论文，2015)。本专利技术所提供的基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，包括分别含有上述RNAα、RNAβ、和RNAγ的人造质粒；并将所需的sgRNA序列整合在RNAβ中或RNAγ中。即，所述载体系统包括：(1)含有RNAα的人造质粒，(2)含有RNAβ并整合有sgRNA的人造质粒，(3)含有RNAγ的人造质粒；或包括：(1)含有RNAα的人造质粒，(2)含有RNAβ的人造质粒，(3)含有RNAγ并整合有sgRNA的人造质粒。所述人造质粒优选为含有HDVRz核酶的质粒，该HDVRz核酶可以使BSMV的基因组RNA得以正确转录出来，并具有侵染性，可以侵染相应的宿主植物。所述含有HDVRz核酶的人造质粒包括但不限于pCB301、pCass4-Rz等。在本专利技术的具体实施方式中，采用人造质粒pCB301构建载体系统，所述人造质粒pCB301为南京农业大学陶小荣教授馈赠(Yao,M.,Zhang,T.,Tian,Z.,Wang,Y.,Tao,X.,2011.ConstructionofAgrobacterium-mediatedcucumbermosaicvirusinfectiouscDNAclonesand2bdeletionviralvector.ScientiaAgriculturaSinica,2011,44(26):4886-4890.)所述人造质粒pCB301上包含一个多克隆位点，通过其中的StuI和BamHI两个酶切位点将大麦条纹花叶病毒的三条基因组RNA分别克隆到pCB301上，产物分别称为pCB301-BSMVα，pCB301-BSMVβ和pCB301-BSMVγ。本专利技术经过实验研究发现，大麦条纹花叶病毒基因组上存在多个可以插入外源片段而不影响病毒本身的复制和运动的位点，例如γb的5`端和3`端；以及外壳蛋白CP的编码序列中间部分可以替换为外源片段而不影响病毒的复制和运动。因此，当将所需的sgRNA序列整合在RNAβ中时，为了使整合的sgRNA序列不影响病毒的系统运动，需将sgRNA表达骨架连同上下游序列在CP基因(编码CP蛋白的基因)核苷酸序列第74-435bp之间的区域中进行插入或替换。在本专利技术的具体实施方式中，作为一种示例性操作，将sgRNA表达骨架连同上下游序列替换了CP基因第74-393位的核苷酸序列。当将所需的sgRNA序列整合在RNAγ中时，为了使整合的sgRNA序列不影响病毒的系统运动，本专利技术选择在γbORF的3’端插入所需sgRNA。本领域技术人员应当理解，sgRNA包含两个部分，位于5`端的spacer部分和紧连着本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，其特征在于，包括分别含有大麦条纹花叶病毒RNAα、RNA β和RNAγ的人造质粒；在RNA β或RNAγ中，整合有所需的sgRNA序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统，其特征在于，包括分别含有大麦条纹花叶病毒RNAα、RNAβ和RNAγ的人造质粒；在RNAβ或RNAγ中，整合有所需的sgRNA序列。


2.根据权利要求1所述的基因编辑载体系统，其特征在于，在RNAγ中γb的5`端或3`端、或RNAβ中外壳蛋白CP编码序列的中间部分整合所需的sgRNA序列。


3.根据权利要求2所述的基因编辑载体系统，其特征在于，将sgRNA表达骨架连同上下游序列在外壳蛋白CP编码序列的第74-435bp之间的区域中进行插入或替换。


4.根据权利要求1-3任一项所述的基因编辑载...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永亮，胡佳成，李大伟，姜志豪，李召雷，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11