本发明专利技术公开了一种用于植物基因剪切的TALE核酸酶精简骨架序列。该骨架N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，中间构建识别特异DNA序列的TALE的重复模块，C端融合有Fok1 Ⅱ型核酸内切酶，在N端和C端插入含有两种不同内切酶的小片段，通过上述两个内切酶可以随意插入TALE的重复模块，构建成能够剪切特异DNA序列TALE核酸酶。利用本TALE核酸酶精简构建八氢番茄红素脱氢酶剪切核酸酶，转化植物后获得白化苗。
Construction of a simplified skeleton of thale nuclease for site-specific cutting of plant genes
The invention discloses a tale nuclease simplified skeleton sequence for cutting plant genes. The N-terminal of the skeleton contains 136 amino acids, and the C-terminal contains 63 amino acids. In the middle of the skeleton, a repeat module is constructed to recognize the specific DNA sequence, and the C-terminal is fused with a Fok1 \u2161 type endonuclease. Small fragments containing two different endonucleases are inserted into the N-terminal and the C-terminal. Through the two endonucleases, the repeat module of the tale can be inserted at will to construct a dale nuclease that can cut the specific DNA sequence. In order to obtain albino plantlets, we used the thale nuclease to simplify the construction of octahydro lycopene dehydrogenase shear nuclease.
【技术实现步骤摘要】
一种用于植物基因定点剪切的TALE核酸酶精简骨架构建
本专利技术属于植物生物
，具体地说构建适合植物表达的TALENs的精简骨架，即N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，中间构建识别特异DNA序列的TALE的重复模块，C端融合有FokIⅡ型核酸内切酶，构建成TALE核酸酶能够剪切特异DNA序列。
技术介绍
近年来兴起的基因组定点编辑技术包括以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(ZFNs),TALE核酸酶(TALENs),以及CRISPR/Cas系统。这些人工核酸酶都可以在DNA靶位点产生DNA双链断裂,它们对基因组定点编辑是通过控制DNA的修复途径实现的。目前主要应用技术有CRISPR/Cas系统和TALENs技术。2009年，美国爱荷华州立大学植物病理、生物信息学和计算生物学计划系的Moscou等（Moscou，Science,2009，326(5959):1501）以及德国马丁·路德大学生物研究所遗传系的Boch等同时在国际著名的自然科学综合类学术期刊《Science》上发表文章（Boch，Science,2009，326(5959):1509-1512），研究报道在植物病原菌黄单胞菌（Xanthomonas）上发现了转录激活子样效应因子（Transcriptionactivator-likeeffectors，TALES），TALES可特异性地结合到DNA上并激活基因表达，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。随后的研究表明，TALES蛋白的DNA结合域由一串连续排列、数目不同（12-30个不等）、序列高度同源的蛋白结构域模块构成，每个模块大小为33-35个氨基酸。模块的第12位和13位的氨基酸对应识别DNA分子四个碱基中的一个。利用TALE序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的（BochandBonas,AnnuRevPhytopathol,2010,48:419-436）。随后，研究人员尝试仿照锌指核酸酶(ZFN)的模式,把TALE中的转录激活结构域(AD)替换成核酸内切酶FokI，从而构成TALE核酸酶(TALENs),对基因组特定靶位点进行定向切割,从而实现基因打靶。正如巡航导弹击中军事目标一样，TALEN可特异识别DNA序列并进行切割，从而进行基因修饰或敲除，使基因操作变得异常简单、方便(Cermak,NucleicAcidsRes,2011,39(12):e82)。TALENs技术可以对基因组靶位点DNA进行结构性缺失、插入、重组、修复等剪辑，实现基因功能性敲除或激活。该技术专利技术后，立即在物种改造和基因治疗领域受到高度重视。短短几年时间内，TALENs技术已经成功应用到了动物细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室基因编辑工具。2012年，美国爱荷华州立大学遗传发育和细胞生物学系的YangBing博士及其同事利用TALENs技术成功地将水稻感病基因Os11N3启动子序列定点切割，使水稻白叶枯病原菌TAL效应子AvrXa7和PthXo3失去对Os11N3基因启动子靶点序列的识别，从而提高了水稻抗白叶枯病的能力。这是世界第一例通过TALENs技术对植物基因组真正实施定点剪辑并获得目标性状改良的植物(YangandWhite,MolPlantMicrobeInteract,2004,17(11):1192-200)。可以预见,TALENs技术在医学和农业基础和应用领域必将发挥越来越有广阔的应用前景,并且产生无可估量的深远影响。关于TALENS技术专利国外只有一项报道，2013年1月美国Minnesota大学和Iowa州立大学公开了利用转录激活因子TALE结构域和FokI内切酶结构区融合构建的转录激活因子核酸酶TALEN专利技术(US20130177960)，但是该专利只限定启动子改造。我国上海斯丹赛生物技术有限公司2013年1月公布了一种单模块DNA文库及TALENs识别模块的连接方法（201310452282）；2014年1月中国农业科学院作物科学研究所公开了一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒，设计并构建了一个通用质粒pSK-RAR-U（201410032382.6）。由于通用pSK-RAR-U能够接受任何一个通过单元装配法组装的dTALE重复区，进而构建dTALEs表达载体的方法简化为：第一步为dTALE重复区序列组装，第二步为将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中，他们利用该载体对黄单胞杆菌进行了基因组定点激活、敲除。TALENS技术的关键是获得针对靶序列的特异TALE蛋白，如果设计识别20个以上碱基的转录激活因子核酸酶TALEN,需要至少2Kb的序列,并且这些序列有高度的重复性,因此在设计的时候存在非常大的难度。目前该技术在植物中应用很少，还没有关于该技术在植物上应用。
技术实现思路
本专利技术为了简化TALENs技术在植物基因编辑中的应用，构建适合植物表达的TALENs的精简骨架，即N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，C端融合有FokIⅡ型核酸内切酶。本专利技术为了便于目的基因的编辑，在TALENs的精简骨架N端和C端，插入一段BamHI和SacI的短序列，通过上述两个酶切位点，插入特异DNA序列的TALE的重复模块。本专利技术利用基因合成方法（xiong2004，核酸研究），按照植物偏爱密码及基因优化原则合成TALENs的精简骨架，N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，C端融合有FokIⅡ型核酸内切酶。N端和C端插入的核苷酸序列为GGATCCCTGGAACACTCCTTGTTTGTTGTGTCAAGCGAGCTC。本专利技术TALENs的精简骨架由CaMV35S启动子控制，终止子为NOS。插入特异DNA序列TALE的重复模块与N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，及FokIⅡ型核酸内切酶构成一个融合基因。本专利技术构建的TALENs的精简骨架成功用于水稻和拟南芥八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase，PDS）基因的剪切，获得高频率的白化苗。附图说明图1植物TALENs的精简骨架表达单元示意图图2水稻和拟南芥八氢番茄红素脱氢酶（phytoenedesaturase，PDS）基因TALEN的植物表达载体SFok1II[TNOsPDS]和SFok1II[TNOsPDS]构建图谱。图3水稻八氢番茄红素脱氢酶剪切后白化苗。图4拟南芥八氢番茄红素脱氢酶剪切后白化苗本专利技术有益效果该专利技术能够高效用于植物基因的定向剪切，从而完成各种植物的定点改造。具体实施方式实施例1：定向编辑植物基因TALENs的精简骨架编码序列的化学合成以基因合成方法（NucleicAcidsResearch,2004,32,e98）合成TALENs的精简骨架。设计的引物为：SplantTALENs-1ATGGACCCAATCCGTTCTCGT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.在植物中高效表达的TALE核酸酶精简骨架序列（SEQ ID NO.1所示）。/n
【技术特征摘要】
1.在植物中高效表达的TALE核酸酶精简骨架序列（SEQIDNO.1所示）。
2.根据权利要求1所示的核苷酸序列，该序列N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，中间通过限制性内切酶插入识别特异DNA序列的...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭日荷，姚泉洪，田永生，高建杰，许晶，付晓燕，李振军，韩红娟，王波，王丽娟，张福建，黄悠楠，张文慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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