一种新型转基因植物标记基因构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种转基因植物用的新型融合标记基因研究。具体过程是：在两个基因的连接处引入了口蹄疫病毒（FMDV）20个氨基酸组成的2A寡肽序列（2A oligopeptide）(QLLNFDLLKLAGDVESNPGP)。在真核细胞内，该寡肽在C端发生切割。利用FMDV2A连接肽编码序列串联绿色荧光蛋白GFP基因，潮霉素抗性基因HPT和除草剂抗性基因Bar，构建三种标记基因的组成型表达单元，并插入植物表达载体，转基因植物中均能够检测到GFP基因、HPT基因和Bar除草剂抗性基因的表达。利用本发明专利技术，可以多种方法筛选转基因阳性植株，有利于转基因植株后代纯合以及假阳性材料的剔除。

Construction and application of a new transgenic plant marker gene

The invention discloses a novel fusion marker gene research for transgenic plants. The specific process is: A 2A oligopeptide (qllnfddllklagdvesnpgp) composed of 20 amino acids of FMDV was introduced at the junction of the two genes. In eukaryotic cells, the oligopeptide cleaves at the C-terminal. The GFP gene, hygromycin resistant gene HPT and herbicide resistant gene bar were linked by fmdv2a linked peptide coding sequence to construct the constitutive expression units of three marker genes and insert them into plant expression vector. The expression of GFP gene, HPT gene and herbicide resistant gene bar could be detected in transgenic plants. By using the invention, the transgenic positive plants can be screened by various methods, which is beneficial to the homozygosity of the offspring of the transgenic plants and the elimination of the false positive materials.

【技术实现步骤摘要】
一种新型转基因植物标记基因构建及应用
本专利技术属于植物生物
，具体地说利用FMDV2A连接肽串联标记基因的方法，通过对串联的基因分别进行验证，以确定该植株为转基因阳性。
技术介绍
外源基因转化到植物需要通过不同阶段的筛选标记来确认，不同筛选标记容易获得真实的转基因植株，但是植物基因表达需要启动子和终止子配套，因此多个标记基因构建比较繁琐。在植物基因表达载体构建过程中，往往由于载体表达组件的缺少或多克隆位点酶切位点的稀少而使目的基因植物表达载体构建受到限制。为了在植物表达载体中使用多个标记基因，增加转基因植物的筛选可信度，本项目利用口蹄疫病毒(FMDV)2A/2B连接区分别将潮霉素抗性基因（HPT）与Bar抗草胺膦抗性基因串联构成双筛选标记的融合基因，将潮霉素抗性基因（HPT）、Bar抗草胺膦抗性基因以及绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联构成双筛选标记和报告基因融合的3基因系统。目前多基因表达策略主要包括表达融合蛋白，构建多顺反子表达载体等。利用内部核糖体进入位点IRES(internalribosomeentrysite)或FMDV2A连接两个或多个基因，可以在真核系统中实现基因的共表达。利用IRES介导的多顺反子表达结构较大，其应用常受到载体容量的限制，当IRES被置于相邻基因中间时有助于双顺反子蛋白的表达，但IRES对位于其后的基因翻译起始能力相对较弱。在多顺反子蛋白的表达中可以用FMDV2A来代替IRES。FMDV2A蛋白约18个氨基酸残基，具有自我剪切活性，其共翻译剪切活性是在自己的C端切割FMDV多聚蛋白，通过核糖体跳跃使2A蛋白和它的下游蛋白发生不连续的翻译(Donnelly,J.Gen.Virol,2001,82：1027-1041;J.Gen.Virol,2001,82：1013-1025)，2A片段的氨基酸连接到上游蛋白C端，一个脯氨酸连接到下游蛋白的N端(Hasegawa,StemCells,2006,24:2649-2660)。目前已在哺乳动物细胞、植物和酵母中观察到2A介导的对多聚蛋白的自我剪切作用。2A介导的相邻基因表达产物通过翻译跳跃来实现分离。序列分析发现，FMDV2A的氨基酸序列高度保守,多肽序列中含有的基序为“-DxExNPGP-”,最后三个氨基酸(-NPG-)则完全保守，并且2B蛋白N端第一个氨基酸Pro也完全保守，该保守元件在2A起始剪切中起到关键作用。研究表明2A和2B总是在Gly和Pro之间切开,动力学和结构模型分析表明，Gly和Pro之间的肽键实际上并未形成(Doronina,Mol.Cell.Biol.,2008,28：4227-4239)。在翻译过程中,2A的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间排阻,使肽基(2A)-tRNA酯键无法形成。由于空间排阻使Pro-tRNA氨基氮亲核进攻无法完成,代之则是肽基(2A)-tRNA酯键的水解作用,形成与2A的融合蛋白,同时核糖体能继续翻译下游蛋白2B,整个过程不需要任何蛋白酶参与(ChinnasamyVirolJ，2006，3:14)。可见,2A能起到类似蛋白水解酶的作用,在2A和2B位点将其顺式切开，FMDV2A独特的剪切机制决定了2A只有在真核翻译系统中有活性,而在原核翻译系统中无活性。FMDV基因表达产物中不存在未剪切的多聚蛋白前体,因此FMDV2A的天然剪切活力可达到100%，(Szymczak,NatBiotechnol,2004,22:589–594),FMDV2A对体外构建的多顺反子剪切效率也能达到85%-95%。体外构建FMDV2A多顺反子的特点是:基因之间以2A序列连接,同时去除上游基因的终止密码子以形成一个长的开放读码框。翻译时多聚蛋白可在编码2A区域的C端被2A切割开,释放出融合了2A多肽尾巴的上游蛋白,以及完整的下游蛋白(刘必胜,生物工程学报,2007,23(5):765-769)。目前,FMDV2A多顺反子系统已被应用于腺病毒(adenovirus)、逆转录病毒(retrovirus)、慢病毒(lentivirus)、腺相关病毒(adeno-associatedvirus)等载体的构建(Osborn,MolTher,2005,12:569–574)。
技术实现思路
本专利技术利用FMDV2A连接肽串联多个筛选标记基因和报告基因。首先按照植物偏爱密码，我们将口蹄疫病毒(FMDV)含有2A蛋白和2B蛋白区LLNFDLLKLAGDVESNPGP19个氨基酸重新设计引物合成，合成的核苷酸序列为：CTGTTGAATTTCGATCTTCTTAAGCTTGCTGGTGATGTTGAATCCAACCCAGGTCCA（SEQIDNO.2所示）。本专利技术通过连续延伸PCR，利用该合成序列将筛选标记基因潮霉素抗性基因（HPT）、草胺膦抗性基因Bar和GFP报告基因片断串联Hygfpbar。本专利技术利用BstEII和BglII双酶切植物表达载体pCAMBIA1301，切除其中的GUS报告基因，通过DNA末端平滑试剂盒处理后，连接获得植物表达载体pCAMBIA1301-GUS。XhoI酶切融合标记基因Hygfpbar，通过T4DNA连接酶将融合标记基因Hygfpbar插入植物表达载体pCAMBIA1301-GUS，替换其中的潮霉素抗性基因，获得植物表达载体pHygfpbar。本专利技术利用电击法将质粒导入根癌农杆菌中。农杆菌介导方法将三价基因表达载体转化单子叶模式植物水稻（Clough1998，植物学杂志）和双子叶模式植物拟南芥，通过检测，获得了转基因植株具有潮霉素和草胺膦抗性，转基因植株组织能表达荧光蛋白。附图说明图1三价标记基因融合基因植物表达载体pHygfpbar构建图谱。图2转基因水稻愈伤组织的潮霉素抗性，水稻幼苗的草胺膦抗性及组织荧光检测。图3转基因拟南芥种子潮霉素抗性、幼苗的草胺膦抗性及组织荧光检测。本专利技术有益效果该标记基因转化植物后，具有多重抗性，可以通过愈伤组织、苗期和成熟植株的检测，有利于加快转基因材料的纯合，同时该载体可以用于多基因表达载体构建。具体实施方式实施例1：标记基因Hygfpbar构建利用重叠延伸PCR串联潮霉素抗性基因（HPT）、绿色荧光蛋白基因EGFP和草胺膦抗性基因Bar。设计的引物为：HPTZ1：5’-CCGCTCGAGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3’（SEQIDNO.3所示）；HPTF1:5’-ACATCACCAGCAAGCTTAAGAAGATCGAAATTCAACAGCTATTTCTTTGCCCTCGGACG-3’(SEQIDNO.4所示)；GFPZ：5’-CTTAAGCTTGCTGGTGATGTTGAATCCAACCCAGGTCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQIDNO.5所示)；GFPF：5’-ACATCACCAGCAAGCTTAAGAAGATCGAAATTCAACAGTCAGATCTCGGTGACGGGCAG-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.优化设计并合成用FMDV2A连接肽串联的HYG基因、GFP基因、Bar除草剂抗性基因（SEQID NO.1所示）。/n

【技术特征摘要】
1.优化设计并合成用FMDV2A连接肽串联的HYG基因、GFP基因、Bar除草剂抗性基因（SEQIDNO.1所示）。


2.根据权利要求1所述的融合标记基因，构建标记基因的植物组成型表达载体。


3.根据权利2要求所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭日荷，姚泉洪，田永生，高建杰，许晶，付晓燕，李振军，韩红娟，王波，王丽娟，张福建，黄悠楠，张文慧，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31