尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法技术

本发明专利技术公开了一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体，是以植物表达载体pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处插入Seq ID No：3所示的序列。还公开了含有前述RNAi载体的微生物转化体。还公开了前述RNAi载体在防治马铃薯干腐病和枯萎病中的应用。还公开了联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法：将前述RNAi载体转入马铃薯中得到转基因马铃薯，采用水杨酸处理转基因马铃薯防治干腐病和枯萎病。本发明专利技术成功构建尖孢镰刀菌RNAi干扰载体，植物激素水杨酸和FoTOR12‑RNAi转基因的联合使用可以非常显著地减弱尖孢镰刀菌的致病力，为防治由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病和干腐病提供了一种有效的方法。

RNAi vector of tor gene of Fusarium oxysporum and its combination with salicylic acid for the control of potato dry rot and Fusarium Wilt

The invention discloses a RNAi vector of tor gene of Fusarium oxysporum, which takes the plant expression vector paelleygate 303 as the skeleton vector and inserts the sequence shown in SEQ ID No: 3 at the recombination site. A microbial transformant containing the RNAi carrier is also disclosed. The application of the RNAi carrier in the control of potato dry rot and Fusarium wilt is also disclosed. The method of joint control of potato dry rot and Fusarium wilt is also disclosed: the RNAi vector is transferred into potato to obtain transgenic potato, and the transgenic potato is treated with salicylic acid to control dry rot and Fusarium wilt. The invention successfully constructs RNAi interference vector of Fusarium oxysporum, the combination of plant hormone salicylic acid and fol12 \u2011 RNAi transgenic can significantly reduce the pathogenicity of Fusarium oxysporum, and provides an effective method for preventing and controlling plant Fusarium Wilt and dry rot caused by Fusarium oxysporum.

【技术实现步骤摘要】
尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法
本专利技术涉及分子生物学和植物病害防治
，具体涉及一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法。
技术介绍
马铃薯属于茄科草本植物，块茎可供食用，是仅次于小麦、水稻和玉米之后的全球第四大重要的粮食作物。中国作为世界上重要的马铃薯生产国，马铃薯种植面积和总产一直居世界首位，预计到2020年，中国马铃薯种植面积将扩大到1亿亩以上，平均亩产提高到1300公斤，总产达到1.3亿吨左右，因此我国马铃薯产业的发展必然对世界马铃薯产业产生重要影响。2015年，农业部提出了马铃薯主食产品及产业开发战略，着力推进马铃薯消费由副食向主食转变、由原料产品向产业化系列制成品转变，让马铃薯成为继水稻、小麦、玉米之后的我国第四大主粮作物。马铃薯枯萎病和干腐病是马铃薯在生长和储存过程中遭受的重要真菌病害。马铃薯枯萎病在美国、乌拉圭、印度、伊朗、意大利等国家都有报道。马铃薯枯萎病在我国的发生也极为广泛，例如：河北、内蒙古、甘肃、新疆、贵州等地都有关于该病的报道。随着我国马铃薯种植面积的不断扩大，连作现象普遍，造成马铃薯枯萎病日益严重，给马铃薯生产造成的损失也愈来愈大。据报道，在贵州的一些种植区马铃薯枯萎病的平均发病率在25％以上；在内蒙古的一些种植区严重地块发病率达78％。据Rakhimov和Khakimov报道马铃薯枯萎病是由茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、雪腐镰刀菌(Fusariumnivale)引起的，1979年首次在希腊发现尖孢镰刀菌可以导致马铃薯枯萎病的发生。在我国引起马铃薯枯萎病的主要病原菌为尖孢镰刀菌(F.oxysporum)。此外，尖孢镰刀菌也是我国马铃薯干腐病的病原菌之一，研究发现河北和内蒙古马铃薯干腐病由4种镰刀菌引起，分别为接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、锐顶镰刀菌(Fusariumacuminatum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和芬芳镰刀菌(Fusariumredolens)。马铃薯干腐病作为一种在田间和窖储都常发生的块茎病害，其常年发病率达到20％～50％。由于马铃薯种子资源的全国性调运，导致马铃薯干腐病有从局部地区向全国各地发展的趋势。因此，防治尖孢镰刀菌对马铃薯产业来说具有重要的经济价值。鉴于尖孢镰刀菌的致病力严重且致病面广泛，尖孢镰刀菌已被研究者列为世界上第三大土传病原真菌。而围绕以枯萎病菌的防治为中心开展的尖孢镰刀菌的致病机理、植物的抗病防御、植物与尖孢镰刀菌二者之间的互作机制也已成为植物病理学界的研究热点。TOR(TargetofRapamycin)是一种存在于真核生物中进化上保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。在多种真核生物中，TOR是细胞生长、新陈代谢、营养、能量、激素、胁迫响应等重要的调节因子；TOR在酵母、植物、动物和人类进化中是一个保守的主调节因子，它整合营养和能量信号来促进细胞增殖和生长。在植物、酵母和哺乳动物等真核生物中，TOR基因的突变都是致死突变。目前对尖孢镰刀菌TOR蛋白在其菌丝生长和致病力方面的功能还鲜有报道。植物激素水杨酸(Salicylicacid；SA)在抵御各种病原菌的侵染过程中发挥着关键性的作用，已有的研究报道显示在病原菌侵染植物时，水杨酸通过激活抗病相关基因的表达来抵御病原菌的侵染。但目前还未见报道水杨酸是否直接进入病原菌体内通过抑制关键靶蛋白的活性来杀灭病原菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体及其与水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法。本专利技术实现其目的采用的技术方案如下：一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体，所述TOR基因RNAi载体是以植物表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处插入SeqIDNo：3所示的序列。一种含有上述RNAi载体的微生物转化体。上述RNAi载体在防治马铃薯干腐病和枯萎病中的应用。一种尖孢镰刀菌RNAi载体和水杨酸联合防治马铃薯干腐病和枯萎病的方法，将上述的RNAi载体转入马铃薯中得到转基因马铃薯，采用水杨酸处理转基因马铃薯防治马铃薯干腐病和枯萎病。在上述的方法中，转基因马铃薯在植株生长过程中喷施水杨酸溶液防治干腐病和枯萎病。本专利技术的有益效果是：成功构建尖孢镰刀菌TOR基因RNAi干扰载体，经实验验证发现植物激素水杨酸和FoTOR12-RNAi转基因的联合使用可以非常显著地减弱尖孢镰刀菌的致病力，为防治由尖孢镰刀菌引起的植物枯萎病和干腐病提供了一种有效的方法。水杨酸是由植物产生的一种天然的抗病化合物，不仅能够大幅度减少化学农药的使用，而且将水杨酸可以作为一种潜在的无污染的生物杀菌剂，对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的现实意义和经济价值。但是单独使用水杨酸防治尖孢镰刀菌的效果有限，而转基因技术与水杨酸的联合应用，可显著减弱尖孢镰刀菌的致病力，植物枯萎病和干腐病的发生显著减少。附图说明图1是不同浓度的水杨酸抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长结果图，其中，A为培养5天后PDA平板情况图，B为扫描电镜下菌丝形态图，C为菌落直径结果，D为相对孢子数量结果。图2是SA减弱尖孢镰刀菌对马铃薯叶片和薯块的致病力结果图，其中，A为尖孢镰刀菌孢悬液接种叶片和薯块培养4天后的情况图，B为坏死斑直径结果，C为菌丝重量结果。图3是针对FoTOR的siRNAs减弱尖孢镰刀菌对马铃薯叶片和薯块的致病力实验结果图，其中，A为尖孢镰刀菌孢悬液和siRNAs混匀后接种叶片和薯块培养4天的情况图，NC为阴性对照，B为坏死斑直径结果，C为菌丝重量结果。图4是P35S::FoTOR12-RI干扰载体构建结果图，其中，A为该载体的结构示意图，B为转基因马铃薯植株的PCR鉴定结果。图5是转基因P35S::FoTOR12-RI马铃薯植株抑制尖孢镰刀菌的致病力结果图，其中，A为尖孢镰刀菌孢悬液接种转基因马铃薯叶片和薯块培养4天后的情况图，B为坏死斑直径结果，C为菌丝重量结果，D为未接菌阴性对照的马铃薯植株生长情况图，E是接菌后正常培养1一个月的马铃薯生长情况图。图6是用SA处理的转基因P35S::FoTOR12-RI马铃薯植株显著的抑制尖孢镰刀菌的致病力结果图，其中，A为尖孢镰刀菌孢悬液和SA混匀后接种转基因马铃薯叶片和薯块培养4天的情况图，B为坏死斑直径结果，C为菌丝重量结果，D为仅使用1mMSA处理的阴性对照组生长情况图，E为尖孢镰刀菌孢悬液和SA混匀后处理的转基因P35S::FoTOR12-RI马铃薯植株正常培养1一个月的情况图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1、植物激素水杨酸(SA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体，其特征在于：所述TOR基因RNAi载体是以植物表达载体pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处插入Seq ID No：3所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种尖孢镰刀菌TOR基因RNAi载体，其特征在于：所述TOR基因RNAi载体是以植物表达载体pEarleyGate303为骨架载体，在重组位点处插入SeqIDNo：3所示的序列。


2.一种含有权利要求1所述RNAi载体的微生物转化体。


3.权利要求1所述的RNAi载体在防治马铃薯干腐病和枯萎病中的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：任茂智，李林宣，祝婷婷，李付广，
申请(专利权)人：中国农业科学院都市农业研究所，中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51