用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测高血压用药相关基因多态性的引物组、试剂盒以及检测方法，引物组选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.360核苷酸序列。本发明专利技术提供的引物组在多重PCR捕获后，可直接进行一轮PCR加接头；采用本发明专利技术的引物组和试剂盒不但操作简单，减少了实验步骤和检验；而且更进一步的降低DNA文库构建的耗材与人力成本；本发明专利技术的180对引物所对应的基因位点可指导的用药种类包含高血压治疗六大类高血压常用药，及高血压高并发症药物：抗凝、抗血小板、降糖、醛固酮、他汀类等常用药物，可以为初诊高血压、H型高血压、难治性高血压、高血压并动脉粥样硬化等并发症的人群治疗方案的选择提供指导，使患者尽早得到有效的治疗。

A kit and method for the detection of drug-related gene polymorphism in hypertension

【技术实现步骤摘要】
用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其是一种用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒和方法。
技术介绍
高血压作为心脑血管病最重要的危险因素，也是我国患病率较高、致残率较高及疾病负担较重的慢性疾病。2016年国家卫生计生委发布的数据显示：我国18岁及以上成人高血压患病率为25.2％，流行态势严重。其主要并发症如卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病等疾病，致残致死率高，严重消耗医疗和社会资源，给家庭和社会造成沉重负担，已成为我国一项重要的公共卫生问题。目前临床上药物治疗是控制血压最有效的措施。药物基因组学研究表明，携带不同基因型的患者在药物吸收、转运、代谢、效应及清除作用过程中可能呈现反应的程度不同。通过检测药物代谢酶和药物靶点基因，可指导临床医生对特定患者选择合适的降压药物和给药剂量，提高降压药物的有效性和安全性。高血压治疗药物种类多样，常用的有利尿剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂、血管紧张素II受体拮抗剂等。且高血压患者往往伴随着心脑血管疾病，需要联合应用调脂药物、抗炎药物、抗凝药物。但市场上的产品只针对一类或某几类甚至一种降压药物，对于初诊高血压患者、难治性高血压患者、H型高血压患者、高血压合并动脉粥样硬化等患者不利于合理进行联合用药指导。在基因检测实现的技术方面，目前用于高血压基因多态性检测的技术一般有：(1)飞行时间质谱技术(2)Taqman探针法(3)Sanger测序法。其中，飞行质谱技术通过MALDI-TOFMS技术根据待检测样本终产物的质荷比(m/z)差异实现检测，灵敏度高且每个反应孔可实现多重反应，无需荧光标记性价比较高；但检测通量较低，且主要应用于检测已知SNP突变，对插入、缺失等突变不完全适用。Taqman探针法同时综合了5’端核酸酶活性和荧光等技术，通过对荧光信号的检测判断样本的基因型，灵敏度高，分型准确，操作简便快捷；但该方法通量不高，只能检测已知突变位点，主要适于对少量位点、大样本进行分型。Sanger测序基于双脱氧核糖核酸(ddNTP)末端终止法，测序长度较长，可发现新的变异位点；但灵敏度不高，对试剂和仪器有特殊要求，速度慢、通量低。相比于以上技术，下一代测序技术(又称高通量测序或第二代测序技术)一次可对几十万到几百万条DNA进行测序，产生数G数据，广泛应用于基因组重测序、Denovo测序、外显子测序、转录组测序以及宏基因组测序等测序技术，并结合生物信息学技术使其在疾病检测、分子育种、物种分析等方面发挥重要作用。且测序成本相对于第一代测序技术大幅下降，是目前正在高速发展中的技术。使用二代测序技术获取目标区域目前主要有两种方法：一种以PCR靶向富集为基础，另一种以探针杂交靶向富集为基础。探针法需要重复覆盖目的片段，因此价格较高；而多重PCR捕获的一般做法是PCR捕获、消化、加接头、纯化、PCR、纯化等一系列步骤，过程繁复操作周期长。综上所述，目前市场上已有的与高血压用药基因检测相关的产品主要存在的问题有以下两点：(1)高血压一般伴随着心脑血管疾病并发症，患者大部分需要联合用药，市场上的产品一般只针对高血压一种或多种高血压药物基因的检测，且不包含相关并发症的药物；(2)虽然下一代测序技术成本大幅下降，但检测价格依然是制约其市场大规模应用的重要因素。其中，建库流程复杂，时间长，耗费人力物力是造成检测时间长，测序成本高的重要原因。
技术实现思路
本专利技术通过以下方面解决了上述技术问题：首先，本专利技术涉及引物组，其选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.360核苷酸序列。其中所述引物组，可以成对使用，所述引物对选自SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；……SEQIDNO.357和SEQIDNO.358；以及SEQIDNO.359和SEQIDNO.360。需要说明的是，本专利技术针对高血压患者常用降压药物、调脂药物、抗凝药物等药物相关基因位点设计上述基本扩增引物组，各条引物长度在为40～48b，难度在于180对引物的扩增条件保持一致，同时又能有效地扩增出目的片段，并且全部引物的Tm值控制在60℃，相差不超过1℃，扩增产物在100～350bp。其中，上游引物P1由两部分组成：一段23bp的固定序列(CCTACACGACGCTGTTCCGATCT)和一段17～25bp特异性片段扩增序列；下游引物同样由两部分组成：有一段22bp的固定序列(CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT)和一段17～25bp特异性片段扩增序列，上游引物和下游引物形成多重PCR扩增引物组；上游引物和下游引物中的固定序列分别与特异性接头P3和P4中的3’端引物相同，多重PCR的扩增产物可直接通过与P3和P4接头引物混合反应，同时达到扩增文库和加标签的目的，以减少文库构建的操作步骤和时间，减少试剂成本、人力成本。本专利技术还涉及用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒，其包含上述的引物组。在一些优选实施方案中，所述相关基因包括但不限于ABCB1、ABCC4、ABCG2、ACE、ACE2、ACY3、ADD1、ADRA1A、ADRA2A、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、AGT、AGTR1、ALDH1A2、ANKFN1、APOA5、APOB、APOE、BDKRB1、BDKRB2、C11orf65、CACNA1C、CALU、CAMK1D、CES1、COQ2、CSMD1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP11B2、CYP3A4、CYP3A5、CYP4F2、DIAPH3、DOT1L、DPYS、EDN1、FBXL17、FTO、GALNT2、GGCX、GNB3、GP1BA、GPR83、GRK4、HMGCR、HMGCS2、ILKAP、KCNH2、KCNJ1、KCNMB1、KIF6、LDLR、LRRC15、LTC4S、MMP3、MTHFR、MTR、NEDD4L、NOS1AP、NOS3、NPHS1、NPPA、NR1H3、NR3C2、PLA2G4A、PLCD3、PLEKHH2、PRCP、PRKCA、PRKCB、PROX1、PTGS1、PTGS2、PTPRD、SLC12A3、SLC14A2、SLC25A31、SLCO1B1、SLIT1、STK39、TCF7L2、TET2、UGGT2、UGT1A1、VASP、VEGFA、VKORC1、WNK1、YEATS4、ZMAT4。在一些优选实施方案中，所述药包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙通道抑制剂、β受体阻滞剂、利尿剂、中枢性降压药六大类高血压常用药，以及高血压高并发症抗凝、抗血小板、降糖、醛固酮、他汀类常用药物。在一些优选实施方案中，所述试剂盒还包括第二轮PCR通用引物P3和P4。在一些优选实施方案中，所述P4的核苷酸序列如SEQIDNO.362所示，P4中“NNNNNNNN”片段为Index标签序列，由dATP、dTTP、dCTP、dGTP任意排列形成。此外，本专利技术还涉及用于检测高血压用药相关基因多态性的方法，包括如下步骤：提取一种或多种样本的DNA；使用上述的引物组以样本DNA为模板进行PCR扩增，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.引物组，其选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.360核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.引物组，其选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.360核苷酸序列。2.权利要求1的引物组，其中，所述引物组是成对使用的，所述引物对选自：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；SEQIDNO.5和SEQIDNO.6；……SEQIDNO.357和SEQIDNO.358；以及SEQIDNO.359和SEQIDNO.360。3.用于检测高血压用药相关基因多态性的试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物组。4.权利要求3的试剂盒，其中所述相关基因包括ABCB1、ABCC4、ABCG2、ACE、ACE2、ACY3、ADD1、ADRA1A、ADRA2A、ADRA2C、ADRB1、ADRB2、AGT、AGTR1、ALDH1A2、ANKFN1、APOA5、APOB、APOE、BDKRB1、BDKRB2、C11orf65、CACNA1C、CALU、CAMK1D、CES1、COQ2、CSMD1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP11B2、CYP3A4、CYP3A5、CYP4F2、DIAPH3、DOT1L、DPYS、EDN1、FBXL17、FTO、GALNT2、GGCX、GNB3、GP1BA、GPR83、GRK4、HMGCR、HMGCS2、ILKAP、KCNH2、KCNJ1、KCNMB1、KIF6、LDLR、LRRC15、LTC4S、MMP3、MTHFR、MTR、NEDD4L、NOS1AP、NOS3、NPHS1、NPP...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏昊强，周煌凯，刘倩，王芳，程祖福，陆嫚云，姚啟聪，
申请(专利权)人：广州海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44