一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测HLA‑B*1502的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术提供的试剂盒包括如下成分：干粉反应管、A Buffer、B Buffer、HLA‑B*1502引物Mix、LbaCas12a（Cpf1）、crRNA、ssDNA、胶体金试纸条、阳性质控品、阴性质控品等成分。采用本发明专利技术提供的试剂盒检测HLA‑B*1502，在试纸条上能清晰、便捷、有效判断结果，使得检测结果肉眼可见，同时无需昂贵复杂仪器：仅需能稳定37℃加热的仪器即可。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒。
技术介绍
癫痫是一种由多种病因引起的大脑神经元反复的、突发的过度异常放电导致的慢性脑部疾病。在任何年龄、地区和种族的人群中都有发病，而儿童和青少年发病率较高。据统计，我国癫痫的年均发病率约35/10万，患病率是5‰左右。抗癫痫药物治疗是最重要和最基本的治疗，也往往是癫痫的首选治疗方案。卡西平/奥卡西平作为特发性全面性癫痫；仅有全面强直阵挛发作的癫痫；儿童良性癫痫伴中央颞区棘波、Panayiotopoulos综合征或晚发性儿童枕叶癫痫等的一线药物，但大约16％的患者出现皮肤型过敏反应，会引起危险的甚至致命的皮肤反应（Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮坏死溶解症，SJS/TEN），严重时出现剥脱性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡，皮肤起水疱，甚至出现全身表皮脱离，如同大面积烫伤，致死性高达40％。这种过敏在南方汉族人群，尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。人类白细胞抗原（Humanleukocyteantigens，HLA）是人类主要组织相容性复合体的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答。HLA-B*1502明确为卡马西平导致剥脱性皮炎的基因标记，癫痫患者可通过基因筛查降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南（试行）》指明：LA-B*1502等位基因与卡西平所致SJS/TEN相关。CPIC（临床药物基因组学实施联盟）（2017）指南也已将HLA-B*1502作为预测卡西平/奥卡西平皮肤毒性的A级药物基因组标记物。CPNDS（加拿大药物基因组学网络）（2014）指南指出，对于携带HLA-B*1502等位基因的患者，不建议使用卡西平。美国FDA已批准在卡西平/奥卡西平药品说明书中增加汉族及东南亚裔人群在服用卡西平/奥卡西平前进行HLA-B*1502等位基因筛查的建议，HLA-B*1502阳性的个体应慎用卡西平/奥卡西平，以避免出现严重的皮肤毒性反应。目前检测方法主要有Sanger测序法、PCR-荧光探针法。但Sanger需要复杂的步骤、昂贵的仪器，且耗时长。PCR-荧光探针法对温度控制要求高，需要昂贵、精密的仪器。市场急需一种简单、快速、便捷的检测HLA-B*1502的方法。近年来，一种以成簇的、规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences，CRISPR)为特征的基因检测技术发展了起来。CRISPR是发现于细菌和古细菌的调控型RNA，含与特定基因互补序列的CRISPR和CRISPR相关蛋白(Cas)形成的复合体具有针对特定基因的内切酶效应，是近年来十分热门和有前景的基因编辑工具。在2015年，张锋等人发现了新的CRISPR相关蛋白内切酶Cas12a(之前称为Cpf1)，它与常用的Cas9蛋白一样是RNA引导的特异性DNA核酸内切酶，但与相比Cas9，Cas12a又有它自身特点，比如仅需要crRNA即可引导特异性切割双链DNA，并产生粘性末端等。Cas12a一旦识别并切割由crRNA序列指定的靶标DNA，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链DNA切成碎片。这种作用称之为附属活性。重组酶-聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在室温(最佳反应温度为37℃)下即可获得可检测级别的扩增核酸。
技术实现思路
针对现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒。采用本专利技术提供的试剂盒检测HLA-B*1502，在试纸条上能清晰、便捷、有效判断结果，使得检测结果肉眼可见，同时无需昂贵复杂仪器：仅需能稳定37℃加热的仪器即可。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒，包括如下组分：干粉反应管、ABuffer、Bbuffer、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a、crRNA、ssDNA、试纸条、阳性质控品、阴性质控品。优选地，所述试剂盒中各组分的量为：干粉反应管30管，ABuffer1.4mL，Bbuffer85μL，HLA-B*1502引物Mix140μL，LbaCas12a70μL，crRNA70μL，ssDNA70μL，试纸条30条，阳性质控品25μL，阴性质控品25μL。优选地，所述HLA-B*1502引物Mix包括HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQIDNO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示。TTCGACAGCGACGCCGCGAGTCCGAGGATGGC（SEQIDNO.1）；GCAGGCTCTCTCGGTAAGTCTGTGTGTTGGT（SEQIDNO.2）;优选地，所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQIDNO.3所示，所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQIDNO.4所示，所述ssDNA的核苷酸序列的前后末端分别标有地高辛和生物素标记。GAUUUAGACUACCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUAUCUCGUCCUCCCCGGCCUCAUAAC（SEQIDNO.3）；Dig-TTTGAAGTGACCAGTAG-biotin（SEQIDNO.4）；优选地，所述试纸条为胶体金试纸条，包括样品垫、胶体金标垫、基膜、吸水垫。优选地，所述胶体金标垫上包含胶体金标记鼠抗地高辛抗体；所述基膜上包含C线及T线，C线为兔抗鼠IgG抗体线，T线是链霉亲和素线。优选地，所述阳性质控品为含HLA-B*1502基因片段的溶液，所述阴性质控品为水。本专利技术还提供了一种利用所述试剂盒快速检测HLA-B*1502的方法，包括如下步骤：S1、取样本核酸进行RPA反应，获得RPA产物；S2、将步骤S1获得的RPA产物经Cas12a-crRNA处理，获得经Cas12a-crRNA处理的产物；S3、将步骤S2所得经Cas12a-crRNA处理的产物进行试纸条检测，判断样本是否属于HLA-B*1502型别。优选地，步骤S1所述的RPA反应过程如下：往干粉反应管中依次加入10μL的ABuffer、2μL的HLA-B*1502引物Mix、3μL的BBuffer、5μL的模板；振荡混匀；3000-5000rpm离心5s；置于恒温金属浴，于37℃下反应20min。优选地，步骤S2所述的Cas12a-crRNA处理过程为：向反应管中加入2μL的LbaCas122μL的crRNA和2μL的ssDNA，振荡混匀；3000-5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：干粉反应管、ABuffer、B buffer、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a、crRNA、ssDNA、试纸条、阳性质控品、阴性质控品；所述HLA-B*1502引物Mix包括HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQ IDNO.2所示；所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3所示，所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.4所示，所述ssDNA的核苷酸序列的前后末端分别标有地高辛和生物素标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测HLA-B*1502的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：干粉反应管、ABuffer、Bbuffer、HLA-B*1502引物Mix、LbaCas12a、crRNA、ssDNA、试纸条、阳性质控品、阴性质控品；所述HLA-B*1502引物Mix包括HLA-B*1502-F及HLA-B*1502-R，所述HLA-B*1502-F的核苷酸序列信息如SEQIDNO.1所示，所述HLA-B*1502-R的核苷酸序列信息如SEQIDNO.2所示；所述crRNA的核苷酸序列信息如SEQIDNO.3所示，所述ssDNA的核苷酸序列信息如SEQIDNO.4所示，所述ssDNA的核苷酸序列的前后末端分别标有地高辛和生物素标记。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏昊强，张天海，陈曦，曹治家，
申请(专利权)人：广州海思医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44