用于便秘风险预测的特异性引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开用于便秘风险预测的特异性引物及其应用，本发明专利技术引物设计的方法如下：通过NCBI获取拟杆菌属、副拟杆菌属、粪球菌属、劳特氏菌属、志贺氏属菌株的全基因组序列；将每个菌株的基因组分为若干50KB的片段，在primer blast找对应属的特异性基因片段，在Clone Manager上设计引物，通过本发明专利技术的引物对能够较好的对便秘人群富集菌群的具体菌种进行鉴别，本发明专利技术的引物能够针对已经注释的基因片段及未知功能的基因片段进行扩增，能够扩增出该种菌属对应的其他菌种上的特异性基因片段，有效提高了检测准确性，便于提高临床人群便秘预测风险的预测准确度。

Specific primers for predicting constipation risk and their applications

【技术实现步骤摘要】
用于便秘风险预测的特异性引物及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及用于便秘风险预测的特异性引物及其应用。
技术介绍
目前对于微生物群落中物种鉴别的研究集中在两个方向：一是以保守性核糖体基因序列(如：16S，ITS序列)为研究目标，从整体水平上看微生物群落的组成；二是以单个物种微生物为研究目标，涉及通过分离纯化，形态学和分子生物学鉴定，或通过denovo宏基因组测序的手段对物种的基因组信息进行解读。概括来说，前者只通过保守序列而确定物种信息显然是不准确的，而后者的实验操作既繁琐又昂贵，并不适于同时批量研究众多微生物物种。具体从定量来说，现在已经能够以核糖体基因如16SrRNA/ITS为扩增主体的门、纲等特异性引物设计并用于相应分类层面的微生物群落结构的定量。但是，通过设计特异性引物和qPCR定量的方法很难实现纲以下分类层面的微生物群落定量。随着高通量测序成本的降低，高通量测序可以在一定程度上解决这个问题，现在通过16SrRNA高通量测序可以即快速又经济实现微生物群落中各物种组成和含量的定量。不过，受高通量测序读长的限制，高通量测序并不能实现16SrRNA基因全长测序，所以对单条序列也只能定位到属，而不能定位到种，这也是受保守序列本身固有的保守性所限制的。从另外一个角度来看，目前具有全基因组信息的物种逐年增多，很多人尝试使用生物信息学手段分析已有微生物的全基因组信息，找出其物种特异性序列，尝试通过设计探针、特意引物等用于后续物种特异性的解析。但是这些引物需要经常更新，因为随着越来越多微生物的基因组序列被测定，以前认为的物种特异性序列很可能失去其特异性，需要定期重新设计。从微生物群落分子生物学研究角度来说，微生物研究经历了依靠分离纯化培养和形态鉴定的形态学研究时代，到目前以微生物基因为研究目标的分子时代。在分子研究方法上可以分为以核糖体文库克隆(如TA克隆)及Sanger测序为代表的一代测序，以IlluminaMiseq为代表的二代测序，以及最新的第三代高通量测序。TA克隆测序样本量不够大，费用也不算便宜，但其测序长度可以实现核糖体基因的几乎全长，可以比较准确地确定复杂菌群中的一批菌种，继而依据这些比较准确的物种信息对多个物种进行测定。便秘是常见的肠道功能失调之一，便秘表现为大便干硬、大便次数少、排便困难等症状，便秘同时可能诱发心、脑血管疾病，引起性生活障碍、痛经、尿路感染等问题，严重影响生活质量。人们对肠道菌群与便秘之前的关系进行了一定的研究，如：毕洪玲，张桂兰，何嫱.便秘患者肠菌群的调查[J].临床军医杂志，2003，31(3):82-84.通过活菌定量培养计数法，动态观察了58例便秘患者粪便菌群的变化规律，并与56例健康人比较。结果健康对照组双歧杆菌、类杆菌、乳酸杆菌、梭杆菌、肠杆菌、肠球菌每克粪便里的活菌数分别是：9.88±0.68，9.02±0.52，8.35±1.21，5.52±1.60，7.82±2.12，7.42±2.42，便秘组上述各活菌数依次为：6.96±0.74，7.03±0.68，7.31±1.32，7.68±1.42，8.71±1.02，7.29±2.01。两组比较，便秘组粪便中的双歧杆菌、类杆菌均减少非常显著(P＜0.01)；乳酸杆菌减少显著(P＜0.05)；梭杆菌增高非常显著(P＜0.01)；肠杆菌增高显著(P＜0.05)，B/E值减低非常显著(P＜0.01)。结论便秘病人肠道菌群的微生态平衡受到破坏，主要表现在以双歧杆菌为主的益生菌数量显著减少，腐败梭菌等条件致病菌数量显著增高。王林，姜军，丁威威，等.顽固性便秘病人结肠黏膜菌群的变化特征[J].肠外与肠内营养，2014，21(1):12-15.通过结肠镜活检获取乙状结肠黏膜标本，提取DNA，PCR扩增后行变性梯度凝胶电泳，应用分子生物学分析软件对菌群结构的相似性、主成分和多样性进行分析。结果：顽固性便秘病人结肠黏膜菌群有明显改变，与对照组比，顽固性便秘病人结肠黏膜菌群物种丰富度和香农多样性指数均显著降低(P〈0.01)。结论：顽固性便秘病人结肠黏膜菌群紊乱，表现为结肠黏膜菌群多样性减少。赵先平，肖新云，蔡锐，等.便秘相关肠道微生物研究进展[J].中国微生态学杂志，2014，26(10):1236-1240.对便秘相关肠道微生物的研究进展进行了综述，认为便秘造成肠道微生态改变，主要益生菌种类和数目减少，而有害菌或条件致病菌却显著增加。具体表现为需氧菌、真菌、大肠埃希菌等显著增加，厌氧菌、类杆菌和双歧杆菌等显著减少。越来越多的证据表明便秘的发生与微生物的改变存在着密切的关系，便秘发生的病人，微生物发生失调，因此菌群的变化可能作为便秘或者便秘前病变的干预靶点。如申请号为CN201811136119.6的专利公开用于便秘风险预测的微生物群及应用，其具体公开了便秘人群中的各种菌类，其通过16s测序方法设计的引物，以此来检测便秘人群富集菌群对应的菌属，但是这种方式检测准确性较低，且无法扩增出对应菌属中的其他菌种，检测受到极大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供用于便秘风险预测的特异性引物及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：用于便秘风险预测的特异性引物，其分别能对拟杆菌属、副拟杆菌属、粪球菌属、劳特氏菌属、志贺氏属菌株上的特异性基因片段进行扩增，获得其对应同种菌属里的多个菌种共有的特异性基因片段，所述特异性基因片段包括注释基因片段及未知功能的基因片段，所述特异性引物包括以下五组：(1)BAC-1F＝5'CTTACCTGCCTTGTCCTGGG3'；TM＝60.04BAC-1R＝5'TACCGTTGGACCGTTCAGTG3'；TM＝59.97产物大小355bp、如序列表SEQIDNO.1-2所示；BAC-2F＝5'CCCTCACGGTACTGGTTCAC3'；TM＝60.04BAC-2R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；TM＝60.61产物大小342bp、如序列表SEQIDNO.3-4所示；BAC-3F＝5'GTTCGCTATCGGTCTCTCGG3'；TM＝60.04BAC-3R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；TM＝60.61产物大小328bp、如序列表SEQIDNO.5-6所示；(2)PAR-1F＝5'GGTGGCGCATTTGAAAGACC3'；TM＝60.39PAR-1R＝5'GTCTGCCATGTTGGCACTTG3'；TM＝60.04产物大小775bp、如序列表SEQIDNO.7-8所示；PAR-2F＝5'AGCCAGCTCGACCTGTAATG3'；TM＝59.82PAR-2R＝5'CGAGCCGATAGGTCTGGTTC3'；TM＝59.97产物大小819bp、如序列表SEQIDNO.9-10所示；PAR-3F＝5'CCCCAAAGCATACCTTTGAACC3'TM＝59.77PAR-3R＝5'GTATGTGGGAGCTGGGAGTG3'；TM＝59.82产物大小777bp、如序列表SEQIDNO.11-12所示；(3)COP-1F＝5'GCTCAATGCTCGAAGCAAAGTC3'；TM＝60.73COP-1R＝5'GG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于便秘风险预测的特异性引物，其特征在于，其分别能对拟杆菌属、副拟杆菌属、粪球菌属、劳特氏菌属、志贺氏属菌株上的特异性基因片段进行扩增，获得其对应同种菌属里的多个菌种共有的特异性基因片段，所述特异性基因片段包括注释基因片段及未知功能的基因片段，所述特异性引物包括以下五组：(1)BAC‑1F＝5'CTTACCTGCCTTGTCCTGGG3'；BAC‑1R＝5'TACCGTTGGACCGTTCAGTG3'；BAC‑2F＝5'CCCTCACGGTACTGGTTCAC3'；BAC‑2R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；BAC‑3F＝5'GTTCGCTATCGGTCTCTCGG3'；BAC‑3R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；(2)PAR‑1F＝5'GGTGGCGCATTTGAAAGACC3'；PAR‑1R＝5'GTCTGCCATGTTGGCACTTG3'；PAR‑2F＝5'AGCCAGCTCGACCTGTAATG3'；PAR‑2R＝5'CGAGCCGATAGGTCTGGTTC3'；PAR‑3F＝5'CCCCAAAGCATACCTTTGAACC3'PAR‑3R＝5'GTATGTGGGAGCTGGGAGTG3'；(3)COP‑1F＝5'GCTCAATGCTCGAAGCAAAGTC3'；COP‑1R＝5'GGCACATAAGCTCGGCATTC3'；COP‑2F＝5'GGACTGATGCAGGGCTGAG3'；COP‑2R＝5'ATGGTCAAGGGATGCACAGG3'；COP‑3F＝5'GTTGATTTATCGGCGGGTGC3'；COP‑3R＝5'GCTTTCACTACATGTTCCGGC3'；(4)BLA‑1F＝5'ATGGCAGAAACAACCAACGC3'；BLA‑1R＝5'CAGCATACGCTTCTCGTTGC3'；BLA‑2F＝5'CATCACGTCTTCCCATTGCAC3'；BLA‑2R＝5'AGGGCCAGAGTCAGTAGGAG3'；BLA‑3F＝5'TGTATGGCTGCTTCTGAGCC3'；BLA‑3R＝5'ACGTGAAAGCAGAGCTGACTG3'；(5)SHI‑1F＝5'GCACCTGGGAAGAAAAAGGC3'；SHI‑1R＝5'TCCGCGTACTCACACAGTTC3'；SHI‑2F＝5'ATCGTTGCGCAGTAATTGGC3'；SHI‑2R＝5'TCGGCATCTGATACGTCTGC3'；SHI‑3F＝5'ATCGCCTGATGCAGATCCAG3'；SHI‑3R＝5'AATTCTCAGGAGAACCCCGC3'。...

【技术特征摘要】
1.用于便秘风险预测的特异性引物，其特征在于，其分别能对拟杆菌属、副拟杆菌属、粪球菌属、劳特氏菌属、志贺氏属菌株上的特异性基因片段进行扩增，获得其对应同种菌属里的多个菌种共有的特异性基因片段，所述特异性基因片段包括注释基因片段及未知功能的基因片段，所述特异性引物包括以下五组：(1)BAC-1F＝5'CTTACCTGCCTTGTCCTGGG3'；BAC-1R＝5'TACCGTTGGACCGTTCAGTG3'；BAC-2F＝5'CCCTCACGGTACTGGTTCAC3'；BAC-2R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；BAC-3F＝5'GTTCGCTATCGGTCTCTCGG3'；BAC-3R＝5'TTGTTGGAGGCTAACGCAGG3'；(2)PAR-1F＝5'GGTGGCGCATTTGAAAGACC3'；PAR-1R＝5'GTCTGCCATGTTGGCACTTG3'；PAR-2F＝5'AGCCAGCTCGACCTGTAATG3'；PAR-2R＝5'CGAGCCGATAGGTCTGGTTC3'；PAR-3F＝5'CCCCAAAGCATACCTTTGAACC3'PAR-3R＝5'GTATGTGGGAGCTGGGAGTG3'；(3)COP-1F＝5'GCTCAATGCTCGAAGCAAAGTC3'；COP-1R＝5'GGCACATAAGCTCGGCATTC3'；COP-2F＝5'GGACTGATGCAGGGCTGAG3'；COP-2R＝5'ATGGTCAAGGGATGCACAGG3'；COP-3F＝5'GTTGATTTATCGGCGGGTGC3'；COP-3R＝5'GCTTTCACTACATGTTCCGGC3'；(4)BLA-1F＝5'ATGGCAGAAACAACCAACGC3'；BLA-1R＝5'CAGCATACGCTTCTCGTTGC3'；BLA-2F＝5'CATCACGTCTTCCCATTGCAC3'；BLA-2R＝5'AGGGCCAGAGTCAGTAGGAG3'；BLA-3F＝5'TGTATGGCTGCTTCTGAGCC3'；BLA-3R＝5'ACG...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏有章，李荣，
申请(专利权)人：武汉小马奔腾医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42