HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法技术

本发明专利技术提供了HIV突变型表面糖蛋白、HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原及其制备方法。所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸；所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原；本发明专利技术提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120蛋白进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。

HIV mutant surface glycoprotein and its nano-antigen and preparation method

【技术实现步骤摘要】
HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法
本专利技术涉及抗原制备
，尤其涉及HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原与制备方法。
技术介绍
人类免疫缺陷综合征(AIDS)于1981年第一次在美国被确诊。自从造成AIDS的病原-人类免疫缺陷病毒(HIV)于1983年被正式确认，HIV已经在全球造成了至少6000万的感染者，其中至少2500万的感染者因病死亡。尽管从2000年以来感染HIV人数的比例总体趋于稳定，但是全球感染的总人数仍然在逐年增长。高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的出现和使用大大减少了新发病例的出现，并且极大的延长了感染者的存活时间，使得人们似乎看到了根除治疗HIV的前景。但是到目前为止，仍然缺少可靠有效的根除HIV的药物以及预防其传播感染的疫苗。同时，欠发达地区还有较高的流行率和新发病例比例，加上当地医疗卫生条件的欠缺、关注度的匮乏，使得AIDS仍然是人类所面临的一个非常严峻的公共卫生问题。因此，诊断发现并知晓自身感染状况是一种公认的易于实施的防控策略，研发出一种效果好、价格合理的自检测试纸条将为我国艾滋病的防控做出巨大贡献，同时也具有广阔的市场前景。HIV表面的糖蛋白Env三聚体由三个非共价连接的gp120和gp41三聚体组成，它们来自于gp160前体蛋白。Env蛋白通常在gp41的跨膜结构域之前被截断，从而产生可溶性Env免疫原。然而，未经修饰的gp120蛋白是不稳定的，不能有效地体外表达和纯化Env三聚体。目前，针对HIV-1的保护性疫苗应该能够诱导广泛中和抗体(bNAbs)，以防止HIV-1的入侵。目前，从HIV-1感染个体中分离出许多bnab，它们以HIV-1包膜糖蛋白(Env)三聚体为靶点，能够中和不同亚型的病毒，这为诱导此类抗体提供了证据。然而，与自然感染相比，目前还没有任何基于免疫球蛋白的疫苗能够诱导bNAbs，原因之一可能是这些疫苗不能再现天然的Env三聚体。因此，如何稳定HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象成为亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种HIV突变型表面糖蛋白及其纳米化抗原，本专利技术提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量；并将HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米化抗原颗粒，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一，在于提供一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。其中，HIV-1野生型表面糖蛋白的DNA序列如SEQIDNO.3所示，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术的目的之二，在于提供所述的杆状病毒的用途，即用于生产一种构象稳定的HIV突变型表面糖蛋白。本专利技术的目的之三，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白，所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的目的之四，在于提供一种DNA分子，它编码所述的HIV突变型表面糖蛋白。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的目的之五，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：S1、用所述的表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒感染sf9细胞，在27±3℃培养；S2、取感染后的P0代病毒液，将杆状病毒从P0代扩增至P3代；S3、从病毒液中分离纯化获得HIV突变型表面糖蛋白。本专利技术的目的之六，在于提供一种HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原，将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原。本专利技术具有的有益效果是：1、本专利技术提供的HIV突变型表面糖蛋白，针对gp120进行半胱氨酸突变，稳定了HIV病毒表面糖蛋白gp120融合前的三聚体构象，通过稳定三聚体构象，进而提高其表达量。2、将所述的HIV突变型表面糖蛋白包被在纳米颗粒表面，成功组装形成HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原颗粒，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片表明组装效果好，从而可将纳米化的抗原用于后期的HIV患者的快速检测。附图说明图1为目的基因扩增结果；其中，M代表Marker，WT为未改造前的HIV-1野生型表面糖蛋白编码蛋白；mutant1为HIV突变型表面糖蛋白；Mock为空白对照组；图2为HIV病毒表面糖蛋白(gp120和gp41)融合前的三聚体构象(PDBnumber：3J5M)；本专利技术的HIV突变型表面糖蛋白即是在gp120的氨基酸位点进行半胱氨酸突变；图3为本专利技术提供的HIV突变型表面糖蛋白SDS-PAGE检测结果；图4为本专利技术提供的HIV突变型表面糖蛋白的western-blot检测结果；图5为HIV突变型表面糖蛋白纳米化抗原检测，HIV突变型表面糖蛋白与铁蛋白自组装成纳米颗粒后的电镜图片。具体实施方式实施例1HIV突变型表面糖蛋白的基因扩增和真核表达质粒构建1、PCR扩增(1)本实验采用重叠PCR进行扩增目的片段，首先利用引物F1和R2、F3和R4(如表1所示)分别进行目的基因扩增；最后用F1和R4引物扩增。由于引入两个半胱氨酸突变，因此分两次引入突变，最终形成双突变，PCR反应体系都是一样的，根据目的片段长短，其延伸时间分别为1-2min。表1(2)每一轮PCR反应的PCR反应体系均为50μL，如表2所示，反应条件为：95℃5min；32个循环，循环反应为：95℃1min，55℃1min，72℃1-3min(视片段长度而定)；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物用于后续进一步扩增。表22、PCR产物或酶切产物的电泳检测PCR或酶切反应结束后，将0.8％的琼脂糖凝胶放入装有1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液没过胶。取PCR或酶切产物5-10μL，加入1/10体积的10×loadingbuffer，混匀后点入胶孔中，同时加入相应的DNAMarker，120V电压电泳。待溴酚蓝电泳至适当位置后，停止电泳，将胶放入凝胶成像系统下观察拍照。3、PCR产物或酶切产物的回收用BioFlux公司的BioSpinGelExtractionKit试剂盒回收目的产物，收集管中即为回收的DNA片段。4、DNA片段与质粒载体的连接反应将回收的DNA片段与线性化载体pFast-bac1于16℃连接过夜得到连接产物，反应体系如表3所示(15μL)；表35、大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)将-80℃冻存的DH5α菌种采用氯化钙法制成大肠杆菌感受态细胞。6、连接产物转化DH5α将所述DNA片段与质粒载体的连接得到的连接产物转化感受态DH5α，涂满整个平板。7、质粒的提取与鉴定于超净工作台中，从平板上挑取单菌落接种到含氨苄抗性的LB液体培养基中，于37℃振荡培养8-10h。用OMEGA公司的质粒小提试剂盒提取质粒；质粒提取完成后，用分光光度计ND-2000Spectropho本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，其特征在于，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种表达HIV突变型表面糖蛋白的杆状病毒，其特征在于，该杆状病毒的表达区位置插入了HIV野生型表面糖蛋白编码序列，并且所述HIV野生型表面糖蛋白编码序列的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。2.如权利要求1所述的杆状病毒的用途，其特征在于，用于生产一种构象稳定的HIV突变型表面糖蛋白。3.一种HIV突变型表面糖蛋白，其特征在于，所述HIV突变型表面糖蛋白的第195位由赖氨酸变为半胱氨酸，并且第427位由苏氨酸变为半胱氨酸。4.如权利要求3所述的HIV突变型表面糖蛋白，其特征在于，所述的HIV突变型表面糖蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。5.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求3-4所述的HIV突变型表面糖蛋白。6.如权利要求5所述的DNA分子，其特征在于，其DNA序列为如SEQIDNO.1所示。7.一种HIV突变型表面糖蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭贵青，王健斌，龚贻洲，周军，许俊峰，李强，
申请(专利权)人：武汉璟泓万方堂医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42