一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法，该系统构建方法的步骤为：1）确定了异源蛋白的插入位点；2）成功构建融合增强型绿色荧光蛋白EGFP的WhNV重组类病毒粒子VLP库；3）的构建融合人禽流感病毒H5抗原蛋白的武汉野田村重组病毒粒子库；4）武汉野田村病毒展示系统的建立；该系统包括1）武汉野田村病毒WhNV衣壳，2）作为异源蛋白插入WhNV衣壳蛋白中的融合蛋白，3）连接子linker，在融合蛋白的N端与C端分别添加小段氨基酸序列作为linker与WhNV衣壳连接。本构建方法方法易行，操作简便，通过本构建方法成功建立的WhNV异源抗原展示系统，为建立高效、稳定、高通用性的流感VLP疫苗开发平台，进而建立多种疫苗及药物开发平台奠定良好基础。

A New Antigen Display System Based on Insect Virus Capsid and Its Construction Method

【技术实现步骤摘要】
一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统及其构建方法
本专利技术属于疫苗制备
，具体涉及一种以在WhNV衣壳VLPs表面高效展示人禽流感病毒抗原的展示系统的构建方法，还涉及一种以在WhNV衣壳VLPs表面高效展示人禽流感病毒抗原的展示系统，该系统将为禽流感疫苗的研发打下基础，同时建立稳定高效的WhNV异源多肽与蛋白展示系统将极大推动对其他新型疫苗及解毒剂的研发，具有相当的应用前景，极大推动生物医学的发展。
技术介绍
利用病毒衣壳VLPs，在其表面展示异源多肽及蛋白抗原的表面展示技术，因其在研发广谱抗病毒疫苗，建立高效、通用性疫苗及药物研发平台方面的重要价值，成为目前国际生物医药研发的热点与前沿。在这一领域，国外科学家及制药公司投入了大量的兴趣与精力[KushnirNetal.2012；GarceaRLetal.2004]。近十几年来，噬菌体表面展示技术已被应用于分子生物学各个领域并推进了生命科学与生物医学的发展；然而，作为一种原核表达系统，其展示的抗原在翻译后修饰、蛋白质正确折叠等方面存在相当大的局限性，很难作为一个有效的疫苗开发平台。相比之下，在真核体系中制备的病毒衣壳表面展示系统使得复杂的翻译后修饰、糖基化等成为可能，从而尽可能保持异源抗原的正确构象及免疫原性。在这一方面，包括人乳头瘤病毒16型（HPV16）VLPs、JohnsonGrassMosaicvirus（JGMV）VLPs、HBVcore蛋白VLPs等，均被用于多肽抗原的表面展示与疫苗研发[SadeyenJRetal.2003；SainiMetal.2003；StorniTetal.2004]，2008年，加拿大科学家利用木瓜花叶病毒（PapMV）的VLPs，成功展示了H1N1流感病毒M2抗原的2-24位氨基酸多肽（M2e），并证明其对小鼠强毒株致死攻击具有良好的免疫保护作用，有可能成为开发流感病毒广谱疫苗的新方法[DenisJetal.2008]，然而，这类病毒VLP表面展示技术也存在着局限性，大部分情况下仅能展示异源抗原的几个到几十个氨基酸的肽段，从而影响其完整的免疫原性，并在产生持久的免疫效果上有所欠缺[López-MacíasCetal.2012]。近年来，野田村病毒科中的FHV因独特的衣壳空间结构特征，成为一种国际上广泛认可的新型高效表面展示系统及疫苗药物开发平台[DestitoGetal.2009；VenterPAetal.2008；ManayaniDJetal.2007]。野田村病毒是单链正义RNA病毒，基因组全长约为4.6kb，包括RNA1（3.1kb）和RNA2（1.5kb）。其中RNA2编码衣壳蛋白前体Proα，在装配过程中180个拷贝的Proα组装成T=3的正二十面体对称结构，经过自我切割后成为成熟的具有感染性的病毒粒子[VenterPAetal.2008]，野田村病毒衣壳有一个中心的β桶状结构，这个结构的反平行链由几个大小和形状不同的裸露在表面的茎环连接。这个β桶状结构在所有的野田村病毒中都高度保守，但是表面的茎环结构（loop）却差别很大、且具有很强的柔韧性（flexibility）。因此，野田村病毒衣壳能够容忍较大的异源多肽或完整蛋白插入到这些茎环结构中，而病毒衣壳蛋白以及插入的异源多肽或蛋白的结构特征均不会有大的影响，从而能有效组装成展示具有天然构象抗原的VLPs。同时，其VLPs表面展示的抗原在正二十面体对称球形颗粒表面以高效价（180个衣壳蛋白拷贝）及高度有序化进行排列。这一特征使得抗原能够与B细胞受体高效结合，从而诱发更为快速而强烈的B细胞增殖及抗体产生。FHV衣壳蛋白包含6个茎环结构，目前在这些茎环中成功融合并展示到其VLPs表面的异源多肽包括HIV包膜蛋白gp41、乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg124-147片段、丙型肝炎病毒E1蛋白315-328片段、FLAG蛋白标签、神经递质NPY、流感病毒HA抗原A螺旋结构域等[DestitoGetal.2009；VenterPAetal.2008；BachmannMFetal.1993；BachmannMFetal.1997；PengMetal.2005；SchiappacassiMetal.1997；BurattiEetal.1996；SchneemannAetal.2012]，而成功展示的完整蛋白（或结构域）则包括松天蛾ω病毒（NωV）衣壳蛋白的免疫球蛋白类似结构域（14kDa）及人炭疽热毒性受体ANTXR2（20kDa）[ManayaniDJetal.2007]，这些研究成果发表在包括《JournalofVirology》、《PLoSPathogens》在内的多篇权威国际学术期刊上，并获得了多项美国及国际专利。其中，利用FHVVLPs展示炭疽热毒性受体ANTXR2及流感病毒HA抗原A螺旋结构域的工作，是近期炭疽热解毒剂及高效疫苗、以及广谱流感病毒疫苗研发方面的重要或突破性进展[ManayaniDJetal.2007；SchneemannAetal.2012]，展现了野田村病毒衣壳展示系统作为高效、高通用性疫苗及药物研发平台的重要价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，该方法易行，操作简便。本专利技术的另一目的是在于提供了一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统，该系统的优点为：（1）该系统的主要组成部分武汉野田村病毒WhNV基因组，其具有结构简单（4.6kb），便于体外的基因操作的特点，目前申请人已经建立了WhNV的反式遗传操作系统，可直接用于异源多肽和蛋白展示系统的构建；（2）使用WhNVVLP进行疫苗开发具有较高的生物安全性；（3）与传统的蛋白表面展示系统相比，WhNV衣壳蛋白展示系统具有更高的异源蛋白拷贝数(180个拷贝)，这使得基于该系统构建的疫苗相比传统的疫苗制备方法能够引起更强烈的免疫反应，从而极大的提高了其医用价值；（4）与FHV蛋白展示系统相比，WhNV衣壳蛋白的容量更大，茎环结构区域也更广，测定结果表明，WhNV衣壳蛋白茎环结构域包含约24个可插入位点，这为筛选高效的疫苗和功能性中和解毒剂提供了广阔的空间；（5）WhNV是专利技术人所在的研究室独立在我国发现的病毒，拥有其完整独立的知识产权，相比为美国所掌握的FHV展示系统，WhNV展示系统更适应我国公共卫生及国防安全的需要；（6）武汉野田村病毒（WhNV）作为异源多肽和蛋白展示系统在许多方面具有明显的优势。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：（1）异源蛋白插入位点的确定：根据生物信息学手段分析WhNV衣壳蛋白的结构，找出其中β桶状结构和表面茎环结构Loop的位置区域，确定Loop中适合插入异源多肽和蛋白的潜在位点；（2）融合增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的WhNV重组类病毒粒子（VLP）库的构建：对Loop区域的插入位点两端添加一小段氨基酸序列作为连接子（linker），通过插入酶切位点等基因改造手段，构建可供方便操作的载体，将EGFP通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入WhNV衣壳蛋白中所有Loop区域的可插入位点，构建两种融合方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：（1）异源蛋白插入位点的确定：根据生物信息学手段分析WhNV衣壳蛋白的结构，找出其中β桶状结构和表面茎环结构Loop的位置区域，确定Loop中适合插入异源多肽和蛋白的潜在位点；（2）融合增强型绿色荧光蛋白EGFP的WhNV重组类病毒粒子VLP库的构建：对Loop区域的插入位点两端添加一小段氨基酸序列作为连接子，通过基因改造手段，构建便操作的载体，将EGFP通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入WhNV衣壳蛋白中所有Loop区域的插入位点，构建两种融合方式的WhNV重组VLP库，通过免疫荧光观察，蔗糖密度梯度离心，电镜观察方法筛选出展示构象的EGFP，病毒粒子组装的WhNV重组VLP库，利用EGFP作为报告基因，获得插入异源蛋白后不影响其结构和抗原性并能形成类病毒粒子的稳定系统；（3）融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204位氨基酸的WhNV重组VLP库的构建：在所述的步骤（2）中使用EGFP筛选出候选插入位点的基础上，结合生物信息学分析，进一步筛选插入位点，同样将人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204 氨基酸结构域通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入插入位点，构建融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50‑204 氨基酸结构域的WhNV重组VLP库，运用电镜技术以及免疫反应活性实验筛选出折叠的高免疫活性的VLP；（4）WhNV展示系统的建立：结合所述的步骤（3）中的结果，通过对不同细胞系、培养基、培养条件的摸索，优化重组VLP的表达系统，对优化后的重组VLP进行免疫反应活性实验，为新型疫苗进行评测，通过所述的步骤（2）与所述的步骤（3）的筛选，进一步确定WhNV Loop上插入位点，结合优化的重组VLP表达系统，建立稳定的WhNV异源多肽和蛋白展示系统。...

【技术特征摘要】
1.一种基于昆虫病毒衣壳的新型抗原展示系统的构建方法，其步骤是：（1）异源蛋白插入位点的确定：根据生物信息学手段分析WhNV衣壳蛋白的结构，找出其中β桶状结构和表面茎环结构Loop的位置区域，确定Loop中适合插入异源多肽和蛋白的潜在位点；（2）融合增强型绿色荧光蛋白EGFP的WhNV重组类病毒粒子VLP库的构建：对Loop区域的插入位点两端添加一小段氨基酸序列作为连接子，通过基因改造手段，构建便操作的载体，将EGFP通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入WhNV衣壳蛋白中所有Loop区域的插入位点，构建两种融合方式的WhNV重组VLP库，通过免疫荧光观察，蔗糖密度梯度离心，电镜观察方法筛选出展示构象的EGFP，病毒粒子组装的WhNV重组VLP库，利用EGFP作为报告基因，获得插入异源蛋白后不影响其结构和抗原性并能形成类病毒粒子的稳定系统；（3）融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50-204位氨基酸的WhNV重组VLP库的构建：在所述的步骤（2）中使用EGFP筛选出候选插入位点的基础上，结合生物信息学分析，进一步筛选插入位点，同样将人禽流感病毒H5抗原蛋白50-204氨基酸结构域通过以linker序列以及不以linker序列为介导的方式插入插入位点，构建融合人禽流感病毒H5抗原蛋白50-204氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：周溪，邱洋，穆敬芳，王赵玮，权甲，方媛，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42