本发明专利技术提供了一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明专利技术所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用本发明专利技术提供的sgRNA组合构建得到的重组表达载体转染水稻植株，能特异性地将xal3基因的启动子区域149nt进行缺失，从而使水稻体内xal3基因失去被白叶枯病菌诱导表达的能力，使缺失该启动子片段的转基因水稻对白叶枯病菌表现出抗性。另外，本发明专利技术提供的方法不影响转基因水稻的其他性状，转基因水稻育性良好。
Specific splicing of sgRNA of xal3 gene promoter in rice using CRISPR/Cas9 system and its application
【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体涉及一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及其应用。
技术介绍
抗病虫育种是农业生产上育种的主要目标之一，水稻白叶枯病由白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae，Xoo)引起，是世界上对水稻危害最大的细菌性病害。目前在水稻中已鉴定出30多个抗白叶枯病菌主效基因，其中有5个是隐性的。xa13是近年来克隆的一个非常特殊的水稻隐性抗白叶枯病基因(Chuetal.2006)，xa13与其显性等位基因Xa13在基因的编码区没差异，但是xa13启动子部分的序列变异导致了其在水稻叶片中的表达显著下降，从而使得水稻植株获得了对白叶枯病菌菌株PXO99特异性的抗性。组成型抑制xa13等位显性基因Xa13的表达可以提高水稻对菌株PXO99抗性，但是同时会导致花粉育性显著下降，表明该基因不仅控制水稻的抗病性还与水稻的育性有关(Bartetal.2006；Chuetal.2006)。在育种上特别是杂交育种中，由于隐性抗性基因的使用并不方便(需要同时改良杂交品种的两个亲本)，因此育种家更重视显性抗性基因的应用，比如Xa21，Xa23或Xa7等。由于致病菌的进化，一种抗病基因在生产上使用几年或者十几年往往会逐步丧失其抗性。隐性抗病基因xa13的功能同时与抗病和育性有关，和以往发现的抗病基因的功能有较大差异，理论上讲，其抗病机理与其它抗病基因也应有较大的差异，是对现有抗病基因资源的重要补充。一般认为CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸酶(ZFN)和TALEN等技术后可用于构建基因定点敲除第三代基因编辑技术，且有效率高、速度快及简单经济的特点。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可能改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguideRNA)，引导Cas9对DNA的定点切割。自从2014年首次在模式植物拟南芥中利用Cas9成功完成了基因组定点编辑(Jiangetal.,2013)，水稻，小麦，玉米还有蘑菇等作物也有成功的报道(Sunetal.,2016；Liuetal.,2017；Hussainetal.,2018)。2014年利用Cas9进行基因编辑成功获得抗白粉病的小麦，2016年抗褐化的Cas9对多酚氧化酶(PPO)基因编辑的蘑菇被美国农业部裁定不需要像传统转基因作物一样需要额外的监管，2016年同样利用该技术获得了抗除草剂的水稻。这表明利用cas9技术获得的基因编辑的作物与传统的转基因作物相比有更大的认可度，在应用推广方面有着巨大的优势。
技术实现思路
有鉴于
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及其应用，利用转基因手段获得无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻。本专利技术提供了一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA，所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体以pYLCRISPR/Cas9-MH为基础，包括依次串联的Cas9基因、U3启动子、g1RNA、U6a启动子和g2RNA。优选的，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述U3启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述U6a启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。优选的，所述U3启动子通过靶点接头T1与g1RNA连接；所述靶点接头T1由Pxal3U3-F和Pxal3U3-R变性退火制得；所述Pxal3U3-F的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述Pxal3U3-R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。优选的，所述U6a启动子通过靶点接头T2与g2RNA连接；所述靶点接头T2由Pxal3U6a-F和Pxal3U6a-R变性退火制得；所述Pxal3U6a-F的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；所述Pxal3U6a-R的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。本专利技术提供了一种用于生产无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻的转基因水稻细胞，其特征在于，所述转基因水稻细胞中含有并能阳性表达上述重组表达载体。本专利技术还提供了上述g1RNA和g2RNA、重组表达载体或转基因水稻细胞在生产无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻中的应用。本专利技术提供了一种无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻生产方法，包括如下步骤：(1)将上述重组表达载体转化到水稻细胞中，得到转化细胞；(2)以所述转化细胞为原料，培养得到再生植物；(3)利用PCR检测技术对所述再生植物进行阳性筛选，得到无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻。优选的，步骤(1)所述水稻细胞为粳稻ZH11的细胞。优选的，步骤(3)所述PCR检测的目的基因为所述重组表达载体自带的标记基因。有益效果：本专利技术提供了一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及其应用。所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。利用本专利技术提供的sgRNA组合构建得到的重组表达载体转染水稻植株，能特异性地将xal3基因的启动子区域149nt进行缺失，从而使水稻体内xal3基因失去被白叶枯病菌诱导表达的能力，使缺失该启动子片段的转基因水稻对白叶枯病菌表现出抗性。另外，本专利技术提供的方法不影响转基因水稻的其他性状，转基因水稻在获得高抗白叶枯性状的同时，无转基因痕迹，且育性良好。附图说明图1为本专利技术实施例1所述重组表达载体的结构示意图；图2为本专利技术实施例1所述重组表达载体在构建过程中所用到的基础载体，其中图2-a为pYLcrispr/Cas9-MH表达载体的结构示意图；图2-b为sgRNA供体载体pYLgRNA-OsU6a～c；-OsU3的结构示意图；图3为本专利技术实施例2所述转基因植株的叶片PCR鉴定，Sourthern拷贝数检测以及PD1-6测序结果；图4为本专利技术实施例4所述PD1-6T0代纯合剪切转基因株系叶片中Xa13基因的相对表达量的检测结果；图5为本专利技术实施例5所述水稻的农艺性状以及抗性结果。图6为本专利技术实施例6所述PCR检测结果。具体实施方式本专利技术在xa13基因的启动子序列，以及该序列中已报道受病原菌调控元件序列，在这个元件序列的上下游各挑选一个cas9切割靶位点，根据这两个靶位点人工设计得到一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA，所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pYLCRISPR/Cas9-MH为基础，包括依次串联的Cas9基因、U3启动子、权利要求1所述g1RNA、U6a启动子和权利要求1所述g2RNA。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述U3启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述U6a启动子的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。4.根据权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，所述U3启动子通过靶点接头T1与g1RNA连接；所述靶点接头T1由Pxal3U3-F和Pxal3U3-R变性退火制得；所述Pxal3U3-F的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；所述Pxal3U3-R的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。5.根据权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，所述U6a启动子通过靶点接头T2与g2R...
【专利技术属性】
技术研发人员：李昌焱，李威，林拥军，马伟华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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