用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，属于基因工程技术领域，所述sgRNA具有如SEQ ID NO.1‑56中的任一种核苷酸序列，本发明专利技术还公开了用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物、表达载体、CRISPR/Cas9系统、试剂盒及其在制备治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途；利用本发明专利技术制备的特异性靶向人NKG2A/KLRC1基因能够精确的靶向人NKG2A/KLRC1基因并实现有效的敲除，同时，所得的人NKG2A/KLRC1基因敲除免疫细胞适用于多种肿瘤细胞模型；该制备方法步骤简单、sgRNA靶向特异性好，CRISPR/Cas9系统的敲除效率高。

SgRNA, expression vectors, kits and their applications for targeted knockout of human NKG2A/KLRC1 gene

【技术实现步骤摘要】
用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA、表达载体、试剂盒及其用途。
技术介绍
CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，CRISPR序列和其相关基因(Cas基因)共同作用，因其特有的RNA介导的核酸内切酶活性得到生物学界的广泛关注。其中，来源于StreptococcusPyogenes为代表的II型DNA内切酶Cas9因其只有一个亚基，结构最为简单，所以应用最为广泛。CRISPR/Cas9系统通过识别特定序列的small-guideRNA(sgRNA)序列定位靶向基因，引导Cas9切割靶向序列，造成双链DNA断裂(Double-strandbreaks,DSB)，在没有模板的条件下，发生非同源重组的末端连接(Non-HomologousEndJoining,NHEJ)DNA修复方式产生碱基的插入或缺失，从而造成移码突变达到基因敲除的目的。与ZFN(ZincFingerNucleas)和TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNucleas)需要研究者根据目的基因设计和植被一对特异性的核酸酶相比，CRISPR/Cas9技术能够快速高效的靶向任意一个或多个基因，并且具有操作简便，可以高通量制备以及成本低等优势。因此，这一技术在免疫细胞改造和基因临床治疗中具有很高的应用前景和价值。CRISPR/Cas9系统中，Cas9靶向切割是依靠sgRNA识别靶序列实现的。虽然靶序列只有20个核苷酸，设计十分简便，但是非特异性结合(脱靶)的几率也相对较大。脱靶会造成出目的基因以外的基因突变，给人体带来不可预估的影响。脱靶效率对基因治疗等临床应用是不可忽视的安全隐患，也是限制该技术发展和应用的主要原因。因此，sgRNA对目的基因的特异性和靶向准确性是目的基因特异性敲除的先决条件。因此，具有高度特异性和准确性sgRNA的设计和制备是CRISPR/Cas9基因敲除的关键。现今，在肿瘤临床治疗中，使用阻断免疫细胞表面的免疫检查点抗体进行的免疫治疗是常用的治疗手段。免疫检查点(ImmuneCheckpoints)是调节系统性免疫稳态与耐受的信号通路。诸多研究表明，肿瘤细胞表面高表达免疫检查点配体，通过结合免疫细胞的免疫检查点达到抑制肿瘤免疫的效果。这一效果在肿瘤抗原特异性的效应T细胞和自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)的肿瘤抑制中尤为突出。特定的免疫检查点的阻断，比如PD-1，能够增强抗肿瘤免疫反应。2018年，刊登在国际著名杂志Cell的最新研究表明，利用抗体阻断免疫检查点NKG2A能够促进NK细胞和效应T细胞对肿瘤的查杀能力，并且通过联合用药在临床实验中取得了很好的疗效。因此，NKG2A是继CTLA-4、PD-1/L1和IDO2之后最具有临床应用价值的肿瘤治疗靶点。但是，利用免疫检查点抗体的治疗并非对所有癌症均有效果。PD-1抗体对黑色素瘤虽然有较好的疗效，但是仅对部分肾癌和肺癌具有效果。其他免疫检查点抗体药物也还处于临床试验阶段，比如NKG2A，目前，已经有很多采用NKG2A抗体进行肿瘤治疗的报道。但是还存在抗体药物作用的短效性、免疫检查点的多样性、药物研发时间过长、抗体价格昂贵等诸多不利因素。相比之下，CRISPR/Cas9技术的优点不言而喻。利用CRISPR/Cas9技术对免疫细胞进行改造，敲除表面免疫检查点相关基因，为实现肿瘤免疫治疗提供了一种新的策略。但是，如上述所讲，设计和制备出精确性和特异性靶向免疫检查点基因的sgRNA是CRISPR/Cas9特异性基因敲除的关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的之一，就在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，以解决上述问题。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是这样的：一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1-56中的任一种所示。本专利技术的目的之二，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的表达载体，采用的技术方案为：所述表达载体表达上述的sgRNA。本专利技术的目的之三，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的CRISPR/Cas9系统，采用的技术方案为，所述CRISPR/Cas9系统包括上述的sgRNA和Cas9蛋白。本专利技术的目的之四，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的试剂盒，采用的技术方案为，所述试剂盒包括表达Cas9蛋白和上述的sgRNA的载体。本专利技术的目的之五，在于提供一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA组合物，采用的技术方案为，所述组合物包括至少两种上述的sgRNA。本专利技术的目的之六，在于提供一种上述的sgRNA在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。本专利技术的目的之六，在于提供一种上述的sgRNA组合物在制备用于治疗肿瘤疾病的免疫细胞药物中的用途。本专利技术是通过下述方法实现的：1.靶向NKG2A/KLRC1基因的sgRNA序列的设计和选择：(a)通过NCBI数据库找到NKG2A/KLRC1基因序列；(b)选择NKG2A/KLRC1基因上的不同的各种剪切形式的共有外显子；(c)在第一个起始密码子ATG之后的共有外显子中找出5’-GGN(19)GG-3’、5’-GN(20)GG-3’或5’-N(21)GG-3’的序列位点；(d)选择不能离起始密码子ATG太近的位点，防止转录后下游另一个ATG开始而出现一个被截短的基因形式，不能保证基因完全失活，同时应当位于整个基因前半段的单个或者相隔一定距离(0-200bp)的成对位点；(e)使用在线数据库NCBI的BLAST或者UCSC的BLAT确定sgRNA的靶序列是否唯一；2.构建sgRNA的寡聚核苷酸双链：(a)在选择的sgRNA序列的5’加上适当的限制性内切酶粘性末端，连接至BsaI切割位点的sgRNA序列添加ACCG，连接至BbsI切割位点的sgRNA序列添加CACC，得到正向寡核苷酸(Forwardoligo)；(如果sgRNA序列在5’端不是以G开始，则在5’端添加一个G后再添加内切酶粘性末端)；(b)根据选择的sgRNA序列，获得其对应DNA的互补链，并且在其5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸(Reverseoligo)；(c)分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸；(d)将合成的正反向sgRNA寡聚核苷酸成对的进行变性、退火，使其碱基配对形成可接入线性U6真核表达的pGL3-2U6-sgRNA体的双链结构；双链结构如下：3.sgRNA寡聚核苷酸质粒的构建：(a)线性化pGL3-2U6-sgRNA载体(结构如图1所示，序列如SEQIDNO.77所示)；(b)将退火的sgRNA寡聚核苷酸双链与线性化pGL3-2U6-sgRNA载体连接获得pGL3-2U6-NKG2A/KLRC1-sg质粒；(c)转化并涂Amp+平板(100μg/ml)；(d)挑取单克隆，在LB培养液中37℃摇床摇菌过夜；(e)取部分菌液，利用SEQIDNO.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑56中的任一种所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1-56中的任一种所示。2.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达权利要求1所述的sgRNA。3.一种用于靶向敲除人NKG2A/KLRC1基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括权利要求1所述的sgRNA和Cas9蛋白。...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓涛，王越，喻堃，李倩，成俊杰，
申请(专利权)人：成都美杰赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51