【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于过继性免疫细胞治疗，具体涉及一种由cd3和cd28组成的抗体组合物在检测免疫细胞抗肿瘤活性中的应用、检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、肿瘤免疫应答早期，循环免疫细胞t细胞可以识别、浸润继而清除某些癌细胞，对正常细胞却不损伤。然而，许多肿瘤通过高表达免疫检查点配体和分泌大量抑制性细胞因子等机制，形成免疫抑制微环境，导致t细胞活性丧失甚至诱导t细胞凋亡，从而产生肿瘤免疫逃逸。
2、pd-1分子属于b7家族成员，是一种重要的免疫抑制分子。pd-1分子通常表达于活化的t细胞和b细胞，pd-1与其配体pd-l1相互作用后发挥免疫抑制作用，在机体免疫耐受维持和免疫应答调节中发挥重要作用。当机体感应到外来抗原时，会产生大量特异性t细胞；持续的抗原刺激则会诱导t细胞pd-1表达，从而导致免疫细胞功能丧失和凋亡耗竭。肿瘤细胞逃避t细胞攻击的一种重要途径是通过肿瘤细胞表面的pd-l1配体与t细胞表面的pd-1受体结合，抑制t细胞活化并诱导其凋亡。
3、pd-1/pd-l1抑制剂疗法是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法。阻断pd-1/pd-l1途径已成为肿瘤免疫治疗的新手段。研究表明，阻断pd-1后，肿瘤位点的t细胞数及ifn-γ分泌增加，高免疫抑制性的髓源性抑制细胞群百分比减少，肿瘤微环境中效应细胞与抑制细胞比例增加，从而对肿瘤微环境动态改变、肿瘤生长控制发挥重要作用。此外，研究表明t细胞表达pd-1蛋白，即使没有与pd-l1配体结合也会导致t细胞功能降低。
4、因此，t细胞表达pd-1蛋白
5、体外检测t细胞pd-1编辑率是评价pd-1基因敲除后pd-1抑制信号通路解除的关键指标，也是预测基因编辑t细胞在体内或体外抗肿瘤活性的重要数据。现有的检测技术包括高通量测序检测pd-1基因编辑率、qpcr检测pd-1 mrna转录水平以及流式细胞术检测t细胞表面的pd-1蛋白表达，而且由于在体外正常培养条件下，低效编辑pd-1基因的t细胞表达pd-1蛋白的比例仍然非常低，不能反应肿瘤微环境下t细胞pd-1蛋白强烈诱导后的表达水平。所以上述三种方法均不能真实反映t细胞在肿瘤微环境下pd-1蛋白表达的真实水平；其中，前两种只能从核酸水平推测pd-1表达情况，而直接的流式检测也不能反映肿瘤微环境下的t细胞状态。因此，亟需一种能够模拟体内肿瘤环境诱导t细胞pd-1表达的方法，可以更准确地预测t细胞抗肿瘤活性。
技术实现思路
1、基于上述背景，本专利技术创建一种由抗体组合物构成的免疫细胞诱导体系，所述诱导体系接近免疫细胞在体内的活化过程，更准确的检测基因编辑的免疫细胞在体内的pd-1表达水平，从而预测抗肿瘤治疗效果。本专利技术预料不到的发现，采用固化的cd3抗体和cd28抗体在体外对免疫细胞进行刺激，再通过流式细胞术快速检测细胞表面pd-1表达情况，可以准确预测基因编辑的免疫细胞在体内pd-1可能被诱导的情况，进而评估基因编辑后的免疫细胞的抗肿瘤活性。
2、本专利技术包括如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种抗体组合物在以下（a）-（b）中任一项的应用：
4、（a）体外检测pd-1诱导后的免疫细胞的抗肿瘤活性；
5、（b）制备用于检测免疫细胞抗肿瘤活性的诊断试剂或试剂盒；
6、所述抗体组合物为cd3抗体与cd28抗体的组合。
7、优选的，所述免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，具体的，所述基因编辑的免疫细胞为pd-1敲除的t细胞或pd-1低表达的t细胞。本领域技术人员可通过常规的基因编辑技术制备得到所述pd-1敲除的t细胞或pd-1低表达的t细胞。
8、第二方面，本专利技术提供一种检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与cd3抗体和cd28抗体共同孵育进行诱导，再通过流式细胞术检测细胞pd-1阳性率，根据pd-1阳性率评估免疫细胞的抗肿瘤活性。
9、所述诱导条件为37℃，5%co2培养箱诱导4-24h。
10、在本专利技术的优选实施方式中，所述诱导时间为24h。
11、在诱导体系中，所述cd3抗体和cd28抗体为可溶性抗体溶液或固化至载体表面。
12、当cd3抗体和cd28抗体为可溶性抗体溶液时，cd3抗体和cd28抗体的终浓度为10-10000ng/ml；优选的，所述cd3抗体和cd28抗体的终浓度为500-10000ng/ml。
13、在本专利技术的优选实施方式中，所述cd3抗体和cd28抗体固化至载体表面。
14、本专利技术所述的固化方式是指本领域技术人员使用常规方法，例如通过包被、偶联等技术将所述抗体组合物固定至载体表面。
15、本专利技术所述的载体包括本领域常规使用的任何可固定蛋白质的固相载体，包括但不限于为细胞板、微球、乳胶颗粒等。
16、所述微球可选自磁性微球（磁珠）、二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或生物大分子聚合物微球。
17、在本专利技术的优选实施方式中，所述载体选自细胞板或磁性微球。
18、在本专利技术给的具体实施方式中，所述载体为细胞板。
19、本专利技术通过如下方法将cd3抗体和cd28抗体固化至载体表面：
20、（1）使用缓冲液将cd3抗体和cd28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
21、（2）将cd3抗体和cd28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
22、（3）在4-37℃下孵育1-48h。
23、在本专利技术的具体实施方式中，所述步骤（3）的孵育方式为37℃下孵育1-2h；或者室温下孵育2-4h；或者4℃下孵育4-48h。
24、在本专利技术的最优选实施方式中，所述检测基因编辑的免疫细胞抗肿瘤活性的方法包括如下步骤：
25、s1：使用pbs将cd3抗体和cd28抗体分别稀释至终浓度为10-10000ng/ml；
26、s2：将cd3抗体和cd28抗体溶液分别加入细胞板的孔中，加入体积分别是100-2000μl/孔；
27、s3：37℃下孵育1-2h；或者室温下孵育2-4h；或者4℃下孵育4-48h，将抗体包被至细胞板上；
28、s4：将待检测免疫细胞加入细胞板孔中，细胞数量为0.1-10×106/孔，37℃，5%co2培养箱中诱导4-24h；
29、s5：通过流式细胞术检测细胞pd-1阳性率。
30、本专利技术提供的免疫细胞与cd3抗体和cd28抗体共同孵育诱导的过程接近免疫细胞在体内本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗体组合物在以下（a）-（b）中任一项的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，所述基因编辑的免疫细胞为PD-1敲除的T细胞或PD-1低表达的T细胞。
3.一种检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与CD3抗体和CD28抗体共同孵育进行诱导，再通过流式细胞术检测细胞PD-1阳性率，根据PD-1阳性率评估免疫细胞的抗肿瘤活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导条件为37℃，5%CO2培养箱诱导4-24h；在诱导体系中，所述CD3抗体和CD28抗体为可溶性抗体溶液或固化至载体表面。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述CD3抗体和CD28抗体固化至载体表面，所述载体选自细胞板、微球或乳胶颗粒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法包括如下步骤：
7.一种试剂盒，所述试剂盒用于检测免疫细胞抗肿瘤活性，所述试剂盒包括CD3和CD28抗体组合物及载体，CD3和CD28抗体组合物固化至所述载
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述固化方式包括包被或偶联，所述载体选自细胞板、微球或乳胶颗粒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述载体选自细胞板或磁性微球。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，通过如下方法将抗体组合物固化至载体表面：
...【技术特征摘要】
1.一种抗体组合物在以下（a）-（b）中任一项的应用：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞是基因编辑的免疫细胞，所述基因编辑的免疫细胞为pd-1敲除的t细胞或pd-1低表达的t细胞。
3.一种检测免疫细胞抗肿瘤活性的方法，所述方法包括使免疫细胞与cd3抗体和cd28抗体共同孵育进行诱导，再通过流式细胞术检测细胞pd-1阳性率，根据pd-1阳性率评估免疫细胞的抗肿瘤活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述诱导条件为37℃，5%co2培养箱诱导4-24h；在诱导体系中，所述cd3抗体和cd28抗体为可溶性抗体溶液或固化至载体表面。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓涛，喻堃，钟立武，李倩，张艳，
申请(专利权)人：成都美杰赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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