【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于单克隆抗体制备的，更具体涉及一种蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
1、蓖麻蚕属于典型的鳞翅目昆虫，与家蚕、柞蚕一起并称为我国的三大绢丝昆虫，也是一种重要的经济昆虫，已经成为我国广泛饲养的绢丝昆虫之一，仅次于我国家蚕和柞蚕的第三大蚕。蓖麻蚕的茧丝性能优良并具有独特的风格，可以作为绢纺原料，纺织高级的织物，用于提取家蚕和柞蚕的溶液并不能很好的用于蓖麻蚕的溶解，蓖麻蚕茧丝中的次要成分茧丝蜡和无机物含量较高，这些无机物与丝胶混合在一起，填充了茧层内茧丝之间的空隙，因此茧层的结构变得更加紧密。此外，茧丝形状较为扁平，增加了茧丝之间的接触面积，进一步增加了茧层的密度和网状结构，这导致蓖麻蚕丝不容易被溶解。目前已有研究在蓖麻蚕丝胶蛋白的单克隆抗体制备，对蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备研究还很有限，但未来会有更多的研究工作致力于蓖麻蚕丝素蛋白看克隆抗体的制备和应用，以探索其在医学、生物技术等领域的潜力。所以找到一种快速溶解蓖麻蚕提取丝素蛋白的方法，制备出特异性高的蓖麻蚕丝素蛋白抗体有着重要的作用。
技术实现思路
1、鉴于此，为实现上述目的，本专利技术提供了一种蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，通过去除蓖麻蚕蚕茧内容物，用铜乙二胺溶液溶解并提取蓖麻蚕丝素蛋白，用蓖麻蚕丝素蛋白粉末作为完全抗原，制备蓖麻蚕丝素蛋白特异性抗体，制备的单克隆抗体特异性强，检测效果好。
2、为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种蓖麻蚕丝素蛋白单克
4、(1)选取蚕茧样品，去掉蚕蛹以及内部蚕蛹排泄物，剥去蚕茧外层，将蚕茧剪碎，用去离子水和乙醇混合液清洗，再在烘箱中烘干；
5、(2)取烘干的蚕茧置于铜乙二胺(ced)溶液中，在55-60℃下溶解1-1.5h,调节ph为8.4-8.6，边滴加边搅拌；
6、(3)取溶解好的溶液倒入透析袋中透析；取透析好的蚕丝溶液进行离心，再将溶液置于冷冻干燥机中处理，最后得到蓖麻蚕丝素蛋白粉；
7、(4)取蓖麻蚕丝素蛋白粉使用生理盐水常温溶解，得到的丝素蛋白溶液与完全弗氏佐剂混合，再进行完全乳化；将乳化好的免疫原在7-10周龄的小鼠的皮下、腹腔进行多点注射；
8、(5)在21天后用不完全弗氏佐剂代替完全弗氏佐剂进行二次免疫，之后收集小鼠的脾细胞，然后将所得融合的杂交瘤细胞在hat培养基中培养和增殖，使用间接elisa的方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选并扩大培养，最终收集上清液采用免疫亲和层析柱进行纯化，得到蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体。
9、进一步优选的，步骤(2)中，所述铜乙二胺溶液的ph为8.4-8.6。
10、进一步优选的，步骤(3)中，所述透析袋的节流分子量为3000-4000，每6-8h换一次水，透析24-30h。
11、进一步优选的，步骤(3)中，所述离心为在12000-14000转/分的转速下离心5-10min。
12、进一步优选的，步骤(4)中，所述生理盐水的浓度为1-3mg/ml。
13、进一步优选的，步骤(4)中，所述完全乳化为使用两个用橡皮管对接的注射器对抗原进行完全乳化，至达到免疫原滴入37℃水中不分散为止。
14、进一步优选的，步骤(4)中，所述注射的剂量为50-100μl。
15、进一步优选的，步骤(5)中，所述二次免疫为：每隔14天加强免疫一次，在四免后的第7天采集小鼠眼眶血液进行检测，选取免疫性能好的小鼠继续注射抗原乳化物到脾脏中，第五次免疫后的第4天，收集小鼠的脾细胞。
16、进一步优选的，步骤(5)中，所述融合的杂交瘤细胞的制备为：将小鼠的脾细胞和sp2/0细胞按照10:1的比例混合均匀，并加入促融合剂聚乙二醇。
17、相比于现有技术，本专利技术具有以下优点：铜乙二胺中的铜离子(cu2+)能够与蚕丝纤维中的两个基团——羧基(cooh)和氨基(nh2)发生化学反应，形成强的化学键，从而破坏了蚕丝纤维的交联结构；同时，铜离子还能与蚕丝中的一些多肽链上的杂原子配位，形成配合物，进一步加剧了蚕丝纤维分子间的松动和溶解；通过调节ph和溶解时间，溶解后用蛋白质组学检测几乎检测不到丝胶蛋白；通过采用铜乙二胺溶液溶解蓖麻蚕并提取丝素蛋白溶液，溶解提取过程简单快速，并且溶解时间短，用本方法提取丝素蛋白并且制备的单克隆抗体特异性强，检测效果好。
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1.一种蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铜乙二胺溶液的pH为8.4-8.6。
3.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析袋的节流分子量为3000-4000，每6-8h换一次水，透析24-30h。
4.如权利要求1或3所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心为在12000-14000转/分的转速下离心5-10min。
5.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生理盐水的浓度为1-3mg/mL。
6.如权利要求1或5所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述完全乳化为使用两个用橡皮管对接的注射器对抗原进行完全乳化，至达到免疫原滴入37℃水中不分散为止。
7.如权利要求1或5所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)
8.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述二次免疫为：每隔14天加强免疫一次，在四免后的第7天采集小鼠眼眶血液进行检测，选取免疫性能好的小鼠继续注射抗原乳化物到脾脏中，第五次免疫后的第4天，收集小鼠的脾细胞。
9.如权利要求1或8所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述融合的杂交瘤细胞的制备为：将小鼠的脾细胞和SP2/0细胞按照10:1的比例混合均匀，并加入促融合剂聚乙二醇。
...【技术特征摘要】
1.一种蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铜乙二胺溶液的ph为8.4-8.6。
3.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述透析袋的节流分子量为3000-4000，每6-8h换一次水，透析24-30h。
4.如权利要求1或3所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离心为在12000-14000转/分的转速下离心5-10min。
5.如权利要求1所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述生理盐水的浓度为1-3mg/ml。
6.如权利要求1或5所述的蓖麻蚕丝素蛋白单克隆抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜浩，李俊婷，李艺畅，张超，吕连鹏，王秉，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：
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