表达白介素的重组溶瘤病毒及其在肿瘤治疗方面的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种表达白介素的重组溶瘤病毒及其在肿瘤治疗方面的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术中所述重组溶瘤病毒在水疱性口炎病毒基因组的G蛋白与L蛋白之间G蛋白的非编码区插入有一个带限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列，并连接有编码白介素DNA序列，所述编码白介素DNA序列的两端含有XhoI和NheI内切酶。所述白介素包括IL

【技术实现步骤摘要】
表达白介素的重组溶瘤病毒及其在肿瘤治疗方面的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达白介素的重组溶瘤病毒及其在肿瘤治疗方面的应用。

技术介绍

[0002]人体免疫系统分为先天免疫系统(固有免疫系统)和后天免疫系统(适应性免疫系统)。先天免疫系统主要以自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞等非特异性免疫细胞为主要组成成分，后天免疫系统主要包括B淋巴细胞、T淋巴细胞等特异性杀伤作用的组分。NK细胞具有广谱的清除病毒、细菌和肿瘤细胞的作用，且在与特异性T细胞配合作用方面有着协同增效的作用。特异性T淋巴细胞经激活后有极少部分在体内变为记忆细胞长期存活，为彻底清除肿瘤细胞和防治肿瘤细胞的转移复发提供了长期保护。
[0003]免疫细胞能够通过识别自体和异体抗原分子来杀灭肿瘤细胞而不损伤正常细胞。部分肿瘤细胞利用这种识别机制，高表达自身正常细胞的表面识别分子，产生免疫抑制微环境，诱导T细胞凋亡，从而产生免疫逃逸。免疫检查点抑制剂类药物，可阻断这种识别抑制作用，让免疫细胞重新被激活工作，消灭癌细胞。针对CTLA
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4和PD
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1/PD
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L1等免疫检查点抑制剂在临床试验中表现出显著的抗肿瘤疗效。免疫检测点抑制剂与NK细胞和T细胞的作用也有越来越深入的认识。
[0004]在T细胞上直接敲除相关的免疫检测点或其组合的细胞制剂现已产生，并显示出较好的临床效果。编辑PD
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1的T细胞制品用于晚期多线治疗无效的非小细胞肺癌患者身上展示出了可行性、安全性和初步的有效性，其结果已于2020年4月28日《Nature Medicine》上全文刊载，为该领域抗肿瘤治疗奠定了扎实的基础。
[0005]溶瘤病毒治疗肿瘤的方法近二十年来发展迅速，并取得了较大的进展，有效策略之一就是减弱或删除病毒毒力因子，使得溶瘤病毒不能在正常组织中复制，但仍保留在癌细胞内复制并维持杀死癌细胞的能力。目前发现某些野生型病毒也具有在癌细胞中选择性复制从而溶瘤的功能。然而，使用溶瘤病毒单独治疗肿瘤的疗效有时并不十分理想，溶瘤病毒与化疗药物联合使用治疗肿瘤时，由于化疗药物对正常细胞同等杀伤，会带来强烈的副作用。溶瘤病毒与免疫检测点抑制剂药物联合使用治疗肿瘤时，其联合效果明显优于单药使用，但由于抗体本身不具备在体内长期存在的基础，且对于T细胞原发或继发减少者疗效有限，对于部分有基因突变患者有用药禁忌等缺点也限制了其进一步的疗效。
[0006]用溶瘤病毒与经改造免疫检测点的T细胞联合治疗的方案是目前最有希望产生突破疗法的治疗方案。现有许多研究发现带有突变的IL
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2既能够诱导T细胞增殖又能够诱导NK细胞增殖，有些还能够诱导DC细胞富集增殖。
[0007]现有技术对溶瘤病毒的改造大多是增强溶瘤能力，表达某种肿瘤特异抗原增加对应CAR
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T或TCR
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T细胞的靶向浸润诱导或表达某种细胞因子增强对T淋巴细胞的激活，而并未考虑到与T淋巴细胞(后天免疫)联用时对先天免疫细胞(如NK细胞及巨噬细胞等)的激活，也没有考虑到对DC类抗原提成细胞的调动和激活。另一方面，现有技术对免疫细胞的改
造大多是通过表达靶向某种癌细胞抗原的嵌合抗原受体增强其靶向杀伤作用。如CAR
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T或TCR
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T等单一靶点修饰的T淋巴细胞制品，因为不能从根本解决肿瘤异质性的问题，反而造成肿瘤人工进化，产生更快的免疫耐受和肿瘤转移等诸多问题。
[0008]因此，如何提供一种上能够表达不同白介素组合的溶瘤病毒，以期实现能够介导T细胞和NK细胞，并能增强DC细胞的富集、活化增殖及形成记忆T细胞的功能，成为现阶段有待研究的技术问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种表达白介素的重组溶瘤病毒及其在肿瘤治疗方面的应用。本专利技术提供了能够表达不同白介素组合的可介导T细胞和NK细胞的溶瘤病毒，能够增强DC细胞的富集、活化增殖及形成记忆T细胞等作用，大大增强抗肿瘤的效果。
[0010]本专利技术的目的之一是提供一种表达白介素的重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒在水疱性口炎病毒基因组的G蛋白与L蛋白之间G蛋白的非编码区插入有一个带限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列，并连接有编码白介素DNA序列，所述编码白介素DNA序列的两端含有XhoI和NheI内切酶。
[0011]本专利技术提供了一种全新的精确改造溶瘤病毒制备的溶瘤病毒减毒株。所述溶瘤病毒为水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)，具体选自水疱性口炎病毒印第安纳株，VSV MuddSummer亚型株。本专利技术对所述水疱性口炎病毒的M蛋白基因进行了定点基因突变，获得减毒株。与野生型VSV及其它已知的VSV减毒株相比，安全性更高，可作为抗原、细胞因子等物质的载体(骨架)，与抗原、细胞因子等结合后，作为疫苗或药物进行使用。同时，也可不与其它物质结合，直接作为溶瘤病毒应用在肿瘤免疫治疗中，其效果也比野生型VSV及其它VSV减毒株的治疗效果更佳。
[0012]本专利技术在溶瘤病毒插入表达白介素的基因，构建了一种溶瘤病毒。白介素在抗原呈递，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
[0013]本专利技术将免疫细胞中表达免疫检查点的基因敲除，可增强T细胞的活性、延长记忆性T细胞的存活时间，增强T细胞对肿瘤细胞的识别，激活其攻击和杀伤功能，通过调动人体自身的免疫功能实现抗肿瘤作用。
[0014]进一步的是，所述白介素包括IL
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2、IL
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12、IL15或IL
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18，以及他们的两两组合。
[0015]进一步的是，所述带有限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列为：GCTACC TATGAAAAAAA CT AACAG AT ATC ACG CTCGAG AATTAA GCTAGC。
[0016]本专利技术的目的之二是提供上述表达白介素的重组溶瘤病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0017](1)人工合成带有限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列，将其插入到VSV基因组中G蛋白与L蛋白之间G蛋白的非编码区，并以此结构为基础构建出用于创建重组水疱性口炎病毒的pVSV
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XN2基因组质粒；
[0018](2)通过基因合成方法，得到编码白介素DNA序列，并使其两端含有XhoI和NheI内切酶DNA序列；
[0019](3)将步骤(2)的合成序列与步骤(1)具有同样酶切位点的pVSV
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XN2基因组质粒进
行体外连接，获得携带白介素基因的水疱性口炎病毒基因组质粒pVSV
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XN2
‑
IL；
[0020](4)将步骤(3)的水疱性口炎病毒基因组质粒pVSV
‑
XN2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达白介素的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述重组溶瘤病毒在水疱性口炎病毒基因组的G蛋白与L蛋白之间G蛋白的非编码区插入有一个带限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列，并连接有编码白介素DNA序列，所述编码白介素DNA序列的两端含有XhoI和NheI内切酶。2.根据权利要求1所述的表达白介素的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述白介素包括IL
‑
2、IL
‑
12、IL15或IL
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18，以及任意两种组合。3.根据权利要求1所述的表达白介素的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述带限制性酶切位点XhoI和NheI的连接序列为：GCTACCTATGAAAAAAACTAACAGATATCACGCTCGAGAATTAAGCTAGC。4.根据权利要求1所述的表达白介素的重组溶瘤病毒，其特征在于，所述水疱性口炎病毒的基因序列如SEQ：No.1所示。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的表达白介素的重组溶瘤病毒的构建方法，其特征在于，包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻堃，邓涛，钟立武，李倩，赵坤，
申请(专利权)人：成都美杰赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：