敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种表达TGF

【技术实现步骤摘要】
敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞及其制备方法与应用
[0001]本申请要求2021年9月29号提交的中国专利申请(申请号：202111150622.9)的优先权，其内容已经纳入本文。


[0002]本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞及其制备方法与应用，该免疫细胞能够高效表达TGF
‑
β抗体。

技术介绍

[0003]研究表明，肿瘤免疫应答早期，循环免疫细胞T细胞可以识别、浸润继而清除某些癌细胞，对正常细胞却不损伤。然而，许多肿瘤通过高表达免疫检查点配体和分泌大量抑制性细胞因子等机制，形成免疫抑制微环境，导致T细胞活性丧失甚至诱导T细胞凋亡，从而产生肿瘤免疫逃逸。
[0004]免疫检查点抑制剂类药物，可阻断这种识别抑制作用，让免疫细胞重新被激活工作，达到消灭癌细胞的目的。已有研究表明，免疫检查点抑制剂在临床试验中表现出显著的抗肿瘤疗效，如CTLA
‑
4抗体可特异地解除CTLA
‑
4对T细胞的免疫抑制，激活T细胞产生IFN
‑
γ和IL
‑
2等。虽然两种免疫检查点抑制剂抗体联用或双特异性抗体的临床试验也在大量进行，但抗体类药物会表现出较强的副作用，制约了其发展应用。
[0005]在T细胞上直接敲除相关的免疫检测点或其组合的细胞制剂，显示出较好的临床效果，并成为当前抗肿瘤治疗新的热点。编辑PD
‑
1的T细胞制品用于晚期多线治疗无效的非小细胞肺癌患者身上展示出可行性、安全性和初步的有效性，其结果已于2020年4月28日在《Nature Medicine》上全文刊载，为该领域抗肿瘤治疗奠定了扎实的基础。
[0006]转化生长因子β超家族(TGF
‑
βsuperfamily)参与调节多样的生物过程(包括但不限于：细胞生长的抑制、组织内稳态、细胞外基质(ECM)重塑、内皮
‑
间充质转化(EMT)、细胞迁移和侵入及免疫调节/抑制，以及间充质
‑
上皮转化)的多种信号传导级联。与ECM重塑相关，TGF
‑
β信号传导可以增加成纤维细胞群体和ECM沉积(例如，胶原蛋白)。在免疫系统中，TGF
‑
β能够结合免疫细胞上的受体，调节免疫细胞功能及维持免疫前体细胞生长和动态平衡；但是，随着肿瘤发生和进展，TGF
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β却对免疫细胞起抑制增殖和降低活性的作用。在这种情况中，TGF
‑
β可以通过刺激血管生成、改变基质环境及诱导局部和系统性的免疫抑制的能力促进变成肿瘤发展。
[0007]尽管文献提示，TGF
‑
β抗体联合免疫检查点抗体能够更有效的抑制肿瘤生长，但是多个抗体联用往往产生非常大的副作用，对于临床应用的风险极大；另外一些研究通过敲除T细胞上的TGF
‑
β受体来阻断TGF
‑
β对T细胞的抑制作用，但是这种作用仅限于被敲除的T细胞本身，并不能阻断肿瘤微环境中其它免疫细胞的抑制。
[0008]如何通过基因敲除手段，来达到消除T细胞免受肿瘤微环境的影响，并实现对免疫检查点抑制通路的完全抑制效果，成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种表达TGF
‑
β抗体且同时敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞及其制备方法与应用。本专利技术提供的免疫细胞不仅进行了免疫抑制基因的敲除，还表达了TGF
‑
β抗体，从免疫抑制点的敲除和肿瘤微环境的解除多方面对免疫细胞进行激活，可以使免疫细胞表现出更好的抗肿瘤能力。
[0010]本专利技术的目的之一是提供一种表达TGF
‑
β抗体且同时敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞，所述免疫细胞敲除PD
‑
1基因，同时还敲除CTLA
‑
4、LAG
‑
3、TIM
‑
3或TIGIT基因。
[0011]具体的，所述PD
‑
1基因的序列如SEQ No.1所示。所述CTLA
‑
4、LAG
‑
3、TIM
‑
3和TIGIT基因的序列分别如SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4、SEQ No.5所示。
[0012]常见敲除运用的编辑体系有质粒与RNP，现有技术对免疫细胞的编辑大多是敲除或敲入，少有对细胞同时进行两种编辑，或编辑率较低，本专利技术采用敲除和敲入同时进行的方法，在同时编辑的情况下保证了编辑效率。另外，现有大多专利仅从免疫检测点角度对免疫细胞进行编辑，而忽视了实体肿瘤微环境中还有其它机制可以抑制免疫细胞。
[0013]因而，本专利技术提供的表达TGF
‑
β抗体且同时敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞，一方面通过分泌TGF
‑
β抗体与TGF
‑
β的结合，解除肿瘤微环境中的高浓度TGF
‑
β对效应T细胞的抑制；另一方面两个免疫检测点基因敲除的免疫细胞，能够免于肿瘤细胞表面的抑制性配体作用，从而保证免疫细胞达到肿瘤部位后，不易受到肿瘤微环境中多种机制的免疫抑制，从而增强免疫抗肿瘤效果。
[0014]本专利技术的目的之二是提供一种sgRNA，所述sgRNA用于敲除如上所述的免疫细胞中的两种免疫检测点基因，其基因序列包括如SEQ No.6和SEQ No.7所示的一对sgRNA序列，或如SEQ No.8和SEQ No.9所示的一对sgRNA序列。
[0015]本专利技术的目的之三是提供上述sgRNA的获得方法，其包括以下步骤：
[0016](1)利用网站针对所要敲除的两个免疫抑制点基因各设计2条sgRNA；
[0017](2)电转染HEK293T细胞筛选出转染效率高的sgRNA。
[0018]本专利技术的目的之四是提供如上所述的免疫细胞的制备方法，其包括以下步骤：
[0019](1)根据PD
‑
1基因的剪切位点设计ssDNA序列，在所述ssDNA序列的左右两端设计与剪切位点互补的左右同源臂，左右同源臂长度均为500bp，在PD
‑
1基因第一外显子的位置敲入TGF
‑
β抗体序列；
[0020](2)按照一定比例配制电转缓冲液，将两个免疫抑制点基因的sgRNA等摩尔量混合，并与Cas9蛋白按比例混合，在25℃下孵育10分钟形成RNP复合物；
[0021](3)将TGF
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β抗体ssDNA溶液与RNP复合物按比例混合配制成电转液，对T细胞悬液进行电转，得到表达TGF
‑
β抗体且同时敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞。
[0022]进一步的是，步骤(1)中所述ssDNA的基因序列如SEQ No.10所示。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达TGF
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β抗体且同时敲除两种免疫检测点基因的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞敲除PD
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1基因，同时还敲除CTLA
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4、LAG
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3、TIM
‑
3或TIGIT基因。2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述PD
‑
1基因的序列如SEQ No.1所示。3.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述CTLA
‑
4、LAG
‑
3、TIM
‑
3和TIGIT基因的序列分别如SEQ No.2、SEQ No.3、SEQ No.4、SEQ No.5所示。4.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA用于敲除如权利要求1所述的免疫细胞中的两种免疫检测点基因，所述sgRNA的基因序列包括如SEQ No.6和SEQ No.7所示的一对sgRNA序列，或如SEQ No.8和SEQ No.9所示的一对sgRNA序列。5.如权利要求4所述的sgRNA的获得方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用网站针对所要敲除的两个免疫抑制点基因各设计2条sgRNA；(2)电转染HEK293T细胞筛选出转染效率高的sgR...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻堃，邓涛，钟立武，王梦阁，
申请(专利权)人：成都美杰赛尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：