一种CAR-T细胞生产方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种CAR

【技术实现步骤摘要】
一种CAR
‑
T细胞生产方法及其应用


[0001]本专利技术属于肿瘤免疫治疗
，尤其涉及一种CAR
‑
T细胞生产方法及其应用。

技术介绍

[0002]CAR
‑
T(Chimeric Antigen Receptor T
‑
Cell Immunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，CAR
‑
T技术在血液肿瘤、淋巴瘤的治疗上具有令人印象深刻的卓越疗效，而在实体瘤方面，还面临着诸多独特的挑战。这些独特的挑战主要包括：缺乏肿瘤细胞特异性的靶点，CAR
‑
T细胞在体内持续存活和扩增的能力不足，低效的肿瘤浸润能力，免疫抑制肿瘤微环境。实际上，科学家们逐渐发现了一些较好的CAR
‑
T治疗靶点，比如胃癌和胰腺癌中的CLDN18.2靶点。然而，即使有可用的靶点，只有同时解决另外三个挑战，CAR
‑
T治疗才有可能对实体瘤产生较好的疗效。
[0003]临床研究发现，过继转移低分化的记忆表型的CAR
‑
T细胞具有更强的抗肿瘤能力和更好的预后，因为它们有更强的在体内持续存活和扩增的能力。产生记忆表型CAR
‑
T细胞并维持T细胞干性的尝试已经有很多，包括使用IL
‑
7和IL
‑
15等细胞因子替代能促进向效应表型转化的IL
‑
2，药物抑制PI3K
‑
AKT通路，激活WNT通路等。但这些方法只能促进CAR
‑
T细胞在体内持续存活和扩增，并不能促进CAR
‑
T细胞肿瘤浸润。最近报道显示，转录因子Runx3能够促进淋巴细胞发育成组织滞留记忆T细胞。在CAR
‑
T细胞中过表达Runx3，促进其发育成组织滞留记忆T细胞，从而利用淋巴细胞组织滞留特性能帮助实体瘤CAR
‑
T锚定在肿瘤部位，这一策略可能解决肿瘤微环境中效应淋巴细胞浸润不足的困境。然而，过表达Runx3不能解决CAR
‑
T细胞在体内持续存活和扩增不足的问题。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种CAR
‑
T细胞生产方法及其应用。本专利技术首先制备过表达Runx3的CAR
‑
T细胞，然后在1μMAKTi1/2环境下扩增过表达Runx3的CAR
‑
T细胞，从而生产出一种新型CAR
‑
T细胞。其中Runx3过表达能增强CAR
‑
T细胞效应功能，并促进CAR
‑
T细胞肿瘤浸润，但不影响AKT抑制剂依赖的T细胞干性的维持，AKT抑制剂的使用则能挽救CAR
‑
T细胞在体内不能持续存活和扩增不足的问题，二者协同、互补，因此生产的新型CAR
‑
T细胞具有更好长期存活、效应和实体肿瘤浸润能力，进而具有更强克服实体瘤困境的综合能力。此外，本专利技术的方法和现有的CAR
‑
T细胞生产流程十分适应，具有巨大的临床应用价值。
[0005]为达上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种CAR
‑
T细胞生产方法，主要包括以下两个步骤：步骤一：制备过表达Runx3的CAR
‑
T细胞；步骤二：在0.5～1.5μM AKTi1/2环境下扩增过表达Runx3的CAR
‑
T细胞。
[0007]优选的，所述步骤一的具体过程为：(1)制备过表达Runx3的CAR病毒表达载体；(2)生产过表达Runx3的CAR病毒；(3)T细胞分离和激活；(4)病毒感染激活的T细胞。
[0008]本专利技术使用联合Runx3过表达和药物抑制AKT策略，生产的新型CAR
‑
T细胞具有更好长期存活、效应和实体肿瘤浸润能力，而且能够改进实体瘤CAR
‑
T细胞疗法的疗效。
[0009]所述Runx3基因为Runt
‑
related transcription factor 3，NCBI数据库中核苷酸序列人源为NM_001031680，鼠源为NM_019732。
[0010]所述AKT抑制剂为Akt Inhibitor VIII，又名AKTi1/2，工作浓度为1μM，分子式为C34H29N7O。
[0011]本专利技术还提供了一种所述CAR
‑
T细胞生产方法在生产人源CAR
‑
T细胞中的应用。
[0012]优选的，所述Runx3为人Runx3，CAR病毒为CAR慢病毒，T细胞为人外周血淋巴细胞。
[0013]优选的，所述步骤(1)中：A.CAR采用三代CAR的组成方式，由人CD8信号肽，scFv片段，人CD8胞外区、CD28跨膜区和胞内段、4
‑
1BB胞内段、CD3ζ胞内段组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；B.人Runx3与CAR通过P2A序列连接，达到人Runx3与CAR共同过表达的目的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；C.所述慢病毒表达载体骨架为pLVX
‑
EF1a
‑
IRES
‑
mCherry；D.用CAR
‑
P2A
‑
RUNX3替换IRES
‑
mCherry，得到过表达人Runx3的CAR慢病毒表达载体pLVX
‑
EF1a
‑
CA9CAR
‑
P2A
‑
Runx3。
[0014]所述CAR为抗人CA9 CAR。
[0015]所述步骤(2)中采用三质粒系统(pLVX、psPAX2、pMD2.G＝4:3:1)，利用磷酸钙转染法共转染293T细胞，从而生产慢病毒。慢病毒上清通过PEG6000法进行浓缩。
[0016]所述步骤(3)中利用人外周血淋巴细胞分离液，从人外周血中分离人外周血单个核细胞。利用Dynabeads Human T
‑
Activator CD3/CD28激活T细胞。T细胞培养于含5％Immune Cell Serum Replacement、100IU/mL IL
‑
2的AIM
‑
V培养基。
[0017]所述步骤(4)中T细胞密度1
‑
3x106/mL，加入慢病毒MOI＝40:1，8μg/ml polybrene、300IU/mL IL
‑
2，32℃，1200g离心感染2小时，升0降0，4小时后换液。
[0018]优选的，所述应用中步骤二的具体过程为：在T细胞扩增时，调整细胞密度至0.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CAR
‑
T细胞生产方法，其特征在于，主要包括以下两个步骤：步骤一：制备过表达Runx3的CAR
‑
T细胞；步骤二：在0.5～1.5μMAKTi1/2环境下扩增过表达Runx3的CAR
‑
T细胞。2.根据权利要求1所述的CAR
‑
T细胞生产方法，其特征在于，所述步骤一的具体过程为：(1)制备过表达Runx3的CAR病毒表达载体；(2)生产过表达Runx3的CAR病毒；(3)T细胞分离和激活；(4)病毒感染激活的T细胞。3.权利要求2所述的CAR
‑
T细胞生产方法在生产人源CAR
‑
T细胞中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Runx3为人Runx3，CAR病毒为CAR慢病毒，T细胞为人外周血淋巴细胞。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中：A.CAR采用三代CAR的组成方式，由人CD8信号肽，scFv片段，人CD8胞外区、CD28跨膜区和胞内段、4
‑
1BB胞内段、CD3ζ胞内段组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；B.人Runx3与CAR通过P2A序列连接，达到人Runx3与CAR共同过表达的目的，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；C.所述慢病毒表达载体骨架为pLVX
‑
EF1a
‑
IRES
‑
mCherry；D.用CAR
‑
P2A
‑
RUNX3替换IRES
‑
mCherry，得到过表达人Runx3的CAR慢病毒表达载体pLVX
‑
EF1a
‑
CA9CAR
‑
P2A
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Runx3。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁廷波，汤江辉，盛剑鹏，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：