富含PTRF蛋白的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种富含PTRF蛋白的外泌体，该外泌体由细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)表达被敲除或敲低的细胞分泌得到。PTRF可作为多种肿瘤外泌体的生物标志物，在外泌体上富集PTRF蛋白对肿瘤的治疗或预防有重要意义。PTRF蛋白对肿瘤的治疗或预防有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
富含PTRF蛋白的外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种富含PTRF蛋白的外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]聚合酶I和转录因子释放因子(PTRF)属于CAVIN蛋白家族成员，其中PTRF在小窝形成和组成中起重要作用。此外，PTRF在核糖体转录环的形成过程中也起着关键作用。
[0003]外泌体是最小的细胞外膜泡，直径约为40～150nm，内含蛋白质、脂质、信使RNA和微小RNA(miRNAs)。它们是在细胞内吞内化过程中由细胞膜产生的，释放到细胞外空间影响受体细胞的功能和生理。因此，它们是细胞间通信的关键串扰因子。外泌体可以在血液和滑膜液中稳定存在。
[0004]目前，已有研究表明，PTRF可作为多种肿瘤(如胶质瘤和肾细胞癌)外泌体的生物标志物。在外泌体上富集这种蛋白对该方向的研究将起到推动作用，或为肿瘤的治疗提供备选的方案。

技术实现思路

[0005]本公开发现泛素连接酶E2O(UBE2O)与PTRF直接相互作用，使PTRF泛素化并最终降解。因此通过敲除UBE2O可以提高PTRF的蛋白含量，从而实现在收集的外泌体中富集PTRF蛋白的效果。
[0006]根据一个方面，提供了一种细胞，所述细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)表达被敲除或敲低。在一些实施方式中，所述细胞可以包括，但不限于，人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT
‑
1080细胞、HeLa细胞、PERC
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6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(MSC)细胞。在优选的实施方式中，所述细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中，所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs和脐带血来源的MSCs。
[0007]在一些实施方式中，所述细胞中的聚合酶I和转录因子释放因子(PTRF)表达升高。在一些实施方式中，所述细胞分泌的外泌体的量升高。
[0008]根据另一方面，提供了一种制备上述细胞的方法，所述方法包括如下步骤：利用基因编辑技术，敲除或敲低所述细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)。
[0009]在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN。在优选的实施方式中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9中使用针对UBE2O的sgRNA序列caccgcatctatcccgtcaacagca(SEQ ID NO.:1)及其互补序列aaactgctgttgacgggatagatgc(SEQ ID NO.:2)。
[0010]根据又一方面，提供了一种外泌体，所述外泌体由本公开的上述细胞分泌。在一些实施方式中，所述外泌体具有表达水平升高的聚合酶I和转录因子释放因子(PTRF)。
[0011]在一些实施方式中，所述外泌体可用于治疗或预防癌症。在一些实施方式中，所述外泌体可用于治疗或预防，例如，但不限于，乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、神经胶
质瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌。
[0012]在一些实施方式中，所述外泌体可以进一步装载有治疗或预防癌症的药物。在一些实施方式中，所述药物可以包括化合物、蛋白质、核酸类治疗物质。
[0013]根据另一方面，提供了一种制备外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)利用基因编辑技术，敲除或敲低细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)；以及，(2)从所述细胞的培养基中分离出外泌体。
[0014]在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN。在优选的实施方式中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9。在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9中使用针对UBE2O的sgRNA序列caccgcatctatcccgtcaacagca(SEQ ID NO.:1)及其互补序列aaactgctgttgacgggatagatgc(SEQ ID NO.:2)。
[0015]在一些实施方式中，所述细胞可以包括，但不限于，人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT
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1080细胞、HeLa细胞、PERC
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6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(MSC)细胞。在优选的实施方式中，所述细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中，所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs和脐带血来源的MSCs。
[0016]在一些实施方式中，所述外泌体具有表达水平升高的聚合酶I和转录因子释放因子(PTRF)。
[0017]根据又一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本公开的外泌体和药学上可接受的载剂。
[0018]根据又一方面，提供了本公开的上述细胞、外泌体或药物组合物在制备用于诊断、治疗或预防癌症的药物中的应用。
[0019]在一些实施方式中，所述外泌体可以用于研究肿瘤发生、迁移和进展的机制，或用于药物筛选的肿瘤模型，或作为肿瘤筛查检测的阳性对照，或作为癌症疫苗预防肿瘤发生。
[0020]在一些实施方式中，所述癌症可以包括，但不限于，乳腺癌、小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌。
附图说明
[0021]图1显示了对照组细胞和两株敲除细胞系中的PTRF含量。
[0022]图2显示了对照组细胞和两株敲除细胞系提取的外泌体的表面标志物鉴定和PTRF蛋白含量分析结果。
[0023]图3显示了对照组细胞和两株敲除细胞系提取的外泌体的电镜分析结果。
[0024]图4显示了对照组细胞和两株敲除细胞系提取的外泌体的纳米颗粒跟踪分析(NTA)结果。
具体实施方式
[0025]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于构成对本专利技术的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
[0026]定义
[0027]除非另有定义，否则本专利技术使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本专利技术所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
[0028]除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
[0029]外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。它是一种直径为30～100nm的纳米级脂质包裹本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞，所述细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)表达被敲除或敲低。2.根据权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT
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1080细胞、HeLa细胞、PERC
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6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞或间充质干细胞(MSC)细胞。3.根据权利要求1或2所述的细胞，其特征在于，所述细胞中的聚合酶I和转录因子释放因子(PTRF)表达升高。4.一种制备权利要求1
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3中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括如下步骤：利用基因编辑技术，敲除或敲低所述细胞中的泛素连接酶E2O(UBE2O)。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选地，所述基因编...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦大江，徐洪杰，岑晓彤，吴迪，
申请(专利权)人：生物岛实验室，
类型：发明
国别省市：