永生化的甲状旁腺细胞株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种永生化的甲状旁腺细胞株及其构建方法，其技术方案是将表达猿猴病毒40大T抗原的质粒包装慢病毒后，转染到人原代甲状旁腺细胞中，培养出永生化的甲状旁腺细胞系；该人甲状腺旁腺主细胞能稳定传代至20代；属于生物技术领域。属于生物技术领域。属于生物技术领域。

【技术实现步骤摘要】
永生化的甲状旁腺细胞株及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物
，更具体而言，涉及一种永生化的甲状旁腺细胞株，本专利技术还涉及该细胞的构建方法。

技术介绍

[0002]甲状旁腺主细胞在机体甲状旁腺素(PTH)的分泌和体内钙磷代谢等方面发挥着重要作用，目前针对甲状旁腺的基础研究多采用原代细胞，原代细胞是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行分离培养。原代培养的甲状旁腺细胞增殖能力弱，一般传代次数为5代左右，并且由于样本来源使得实验受限，目前缺乏人来源的永生化甲状旁腺主细胞株。
[0003]相比于原代细胞，永生化的细胞株增值能力变强。永生化是指将一些外源基因导入细胞，使得细胞增殖能力变强并能够保留原代细胞的特殊性质或标志物。永生化细胞的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种永生化的甲状旁腺细胞株。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供上述永生化的甲状旁腺细胞细的株的构建方法。
[0006]为此，本专利技术提供的第一个技术方案是这本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种永生化的甲状旁腺细胞株，其特征在于，将表达猿猴病毒40大T抗原的质粒包装慢病毒后，转染到人原代甲状旁腺细胞中，培养出永生化的甲状旁腺细胞系。2.根据权利要求1所述的永生化的甲状旁腺细胞株，其特征在于，所述的人原代甲状旁腺细胞为经过处理后的甲状旁腺腺瘤切除术患者术后的部分组织。3.根据权利要求1所述的永生化的甲状旁腺细胞株，其特征在于，人甲状腺旁腺主细胞能稳定传代至20代。4.权利要求1所述的永生化的甲状旁腺细胞株的构建方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1)人甲状腺旁腺细胞的分离培养2)免疫荧光鉴定(1)细胞爬片取玻璃片置于六孔板中，用75％的酒精浸泡过夜，然后每孔加入3ml PBS，洗2遍，接着每孔加入培养基1.5mL，再加入细胞0.02million个/孔；37℃培养箱中培养24h；(2)固定从培养箱中取出细胞，弃去培养基，用PBS洗2遍，然后加入4％PFA室温下固定15min，用PBS洗3次，每次6min，4℃过夜；(3)透化及封闭将玻片的水分尽可能吸干，用免疫组化笔绕玻片一周画圈，每个玻片滴加100μl0.5％Triton
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100透化12min，接着每个孔滴加100μl5％BSA封闭液，室温下封闭30min；(4)孵育一抗封闭后，直接将一抗按对应的比例稀释，每孔加入100μl抗体，4℃过夜；(5)孵育二抗将一抗对应种属的二抗按1∶100稀释，每孔加入100μl二抗，室温避光孵育1h，PBS洗3次，每次6min，染含DAPI的PBS 5min，PBST洗3次，每次5min；(6)封片在载玻片上各滴1滴Fluoromount
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G，用5ml注射器的针头挑出六孔板中的玻片，将有细胞的一面朝向载玻片，封片后将玻片置于4℃冰箱，晾干后可在荧光显微镜下观察；3)、转染(1)将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
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105个，待细胞贴壁后，换液，(2)加入1mL完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒，混匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：马建超，蒋楠，刘双信，徐丽霞，李博厚，柯贵宝，张凤霞，吴琼，温似春，邓淑婷，赵泽文，袁也，陈柏锡，彭思琪，夏郁彬，陶一鸣，王文建，梁馨苓，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：