一种制备外泌体的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了抗炎因子在促进外泌体产生的应用，所述抗炎因子选自IL

【技术实现步骤摘要】
一种制备外泌体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种富含CD81的外泌体的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体是最小的细胞外膜泡，直径约为40～100nm，内含蛋白质、脂质、信使RNA和微小RNA(miRNAs)。它们是在细胞内吞内化过程中由细胞膜产生的，释放到细胞外空间影响受体细胞的功能和生理。因此，它们是细胞间通信的关键串扰因子。外泌体可以在血液和滑膜液中稳定存在。
[0003]间充质干细胞具有自我更新和多谱系分化的潜力，对于组织修复和基因治疗有很大作用。间充质干细胞也表现出免疫细胞的某些特征，能够通过旁分泌作用释放大量的细胞因子和生长因子。因此，间充质干细胞分泌的外泌体具有组织修复的作用。但是，间充质干细胞分泌的外泌体量，以及外泌体所表达的各种细胞因子和生长因子量均有限，无法满足临床应用。
[0004]因此需要开发一种能够提高所需的外泌体的产量，且提高其表达所需细胞因子表达水平的方法。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本专利技术提供了抗炎因子IL
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4、IL
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10和IL
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13在促进外泌体产生的应用，以及制备外泌体的方法。
[0006]根据一个方面，提供了抗炎因子在促进外泌体产生的应用，其中所述抗炎因子选自IL
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4、IL
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10和IL
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13中的一种或多种。
[0007]在一些实施方式中，所述外泌体具有表达水平升高的CD81。
[0008]在一些实施方式中，所述外泌体可以由宿主细胞，例如哺乳动物细胞产生。在一些实施方式中，所述宿主细胞可以包括，但不限于，人胚胎肾(HEK)细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HT
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1080细胞、HeLa细胞、PERC
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6细胞、CEVEC细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、上皮细胞和间充质干细胞(MSC)细胞。在优选的实施方式中，所述宿主细胞可以为间充质干细胞。在具体的实施方式中，所述间充质干细胞可以包括骨髓来源的MSCs、脂肪来源的MSCs、脐带血来源的MSCs。
[0009]在一些实施方式中，所述抗炎因子能够促进CD81阳性外泌体的产生。在一些实施方式中，所述抗炎因子能够富集CD81阳性外泌体。
[0010]根据另一方面，提供了一种制备外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码抗炎因子的核苷酸序列导入宿主细胞中；以及，(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。
[0011]在一些实施方式中，所述编码抗炎因子的核酸序列位于慢病毒载体中。在具体的实施方式中，所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5
’
LTR，3
’
LTR，位于5
’
LTR和3
’
LTR之间的所述编码抗炎因子的核苷酸序列，以及与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作连接的启动
子和翻译起始序列。
[0012]在一些实施方式中，在步骤(1)中，使用所述慢病毒载体感染所述宿主细胞。
[0013]在一些实施方式中，所述5
’
LTR和所述3
’
LTR的U3可以被缺失或突变。在优选的实施方式中，所述3
’
LTR是缺失了U3区域的3
’
LTR(ΔU3/3
’
LTR)。在一些实施方式中，所述5
’
LTR是缺失形式的5
’
LTR(Δ5
’
LTR)。
[0014]在一些实施方式中，所述慢病毒载体的5
’
LTR的启动子被替换成异源启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子。
[0015]在一些实施方式中，与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作地连接的启动子选自：短延伸因子1α(EF1α)启动子、RSV启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子或其转录活性片段。
[0016]在一些实施方式中，与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作地连接有RSV启动子，EF1α启动子和Kozak翻译起始序列。
[0017]在一些实施方式中，所述慢病毒载体还可包括筛选标记物。在一些实施方式中，所述筛选标记物可以选自荧光素酶、(增强的)绿色荧光蛋白、链霉亲和素结合肽、嘌呤霉素抗性基因、氨苄抗性基因、卡那霉素抗性基因和新霉素抗性基因中的一种或多种。在一些实施方式中，所述筛选标记物可以包括增强的绿色荧光蛋白(EGFP)和嘌呤霉素抗性基因(Puro)。
[0018]在一些实施方式中，所述慢病毒载体还可包括SV40早期pA。
[0019]在一些实施方式中，所述慢病毒载体的转录后调控元件包括土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。
[0020]在一些实施方式中，所述慢病毒载体包含逆转录病毒输出元件。“逆转录病毒输出元件”是指调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。优选地，所述逆转录病毒输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)和乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)。
[0021]在一些实施方案中，所述慢病毒载体可以包含中央多聚嘌呤区(cPPT)或中心终止序列(CTS)作为顺式作用元件，cPPT/CTS序列可以是HIV1的cPPT/CTS，能够提高载体整合和转导效率。
[0022]在一些实施方式中，所述慢病毒载体从5
’
LTR区到3
’
LTR区依次包括：RSV启动子，5
’
LTR，Ψ序列，EF1α启动子，Kozak翻译起始序列，编码抗炎因子的核苷酸序列，SV40，Kozak翻译起始序列，EGFR/Puro，WRPE，ΔU3/3
’
LTR和SV40早期pA。在一些实施方式中，所述抗炎因子包括IL
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10，IL
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13和IL
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4。在优选的实施方式中，编码IL
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10、IL
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13和IL
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4的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
[0023]本领域技术人员应理解，编码IL
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10、IL
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13和IL
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4的核苷酸序列的顺序可以改变，只要是IL
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10、IL
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13和IL
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4可以在宿主细胞中同时表达即可。
[0024]在一些实施方式中，编码IL
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10、IL
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13和IL
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4的核苷酸序列之间被编码2A肽的核苷酸序列间隔开。在一些实施方式中，所述2A肽为T2A肽、P2A肽、E2A肽或F2A肽。优选地，所述2A肽本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗炎因子在促进外泌体产生的应用，其中所述抗炎因子选自IL
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4、IL
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10和IL
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13中的一种或多种，优选地，所述外泌体具有表达水平升高的CD81。2.一种制备外泌体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码抗炎因子的核苷酸序列导入宿主细胞中；以及，(2)从所述宿主细胞的培养基中分离出外泌体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述编码抗炎因子的核酸序列位于慢病毒载体中，优选地，所述慢病毒载体包括含有ψ序列的5
’
LTR，3
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LTR，位于5
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LTR和3
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LTR之间的所述编码抗炎因子的核苷酸序列，以及与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作连接的启动子和翻译起始序列。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5
’
LTR和所述3
’
LTR的U3被缺失或突变，优选地，所述3
’
LTR是缺失了U3区域的3
’
LTR(ΔU3/3
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LTR)，优选地，所述5
’
LTR是缺失形式的5
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LTR(Δ5
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LTR)，优选地，所述5
’
LTR的启动子被替换成异源启动子，优选被替换成巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或猿猴病毒40(SV40)启动子，优选地，与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作地连接的启动子选自短延伸因子1α(EF1α)启动子、RSV启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子或其转录活性片段，优选地，与所述编码抗炎因子的核苷酸序列可操作地连接有RSV启动子，...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦大江，徐洪杰，吴迪，
申请(专利权)人：生物岛实验室，
类型：发明
国别省市：