用于表征用于治疗的CART细胞的方法和试剂技术

本文提供了用于分析工程改造的免疫细胞诸如CAR T细胞的属性的方法、试剂盒和试剂。例如，本文提供了确定同种异体CAR T细胞药品中的剩余的TCRαβ+CAR T细胞的数量或百分比，以及表征CAR T细胞药品的其他重要属性的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征用于治疗的CAR T细胞的方法和试剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年12月14日提交的美国临时申请63/125,149；和2021年12月7日提交的美国临时申请63/265,086的优先权权益，这两份申请的内容据此以引用的方式整体并入。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，该序列表以ASCII格式通过电子方式提交并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年12月10日，命名为AT
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037_03WO_SL.txt，并且大小为8,915字节。

技术介绍

[0005]嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法已经取得了前所未有的成功，但是CAR T细胞的制备也面临着前所未有的挑战。与来源于患者自身细胞的CAR T细胞(自体CAR T细胞)相比，来源于同种异体供体细胞的CAR T细胞(同种异体CAR T细胞)可以作为现成产品产生，成本更低，制备过程更简单。虽然有这些优点，但是在同种异体CAR T细胞制备中仍然存在独特的挑战。在同种异体环境中，减轻移植物抗宿主病(GvHD)的一种方式是破坏TCRα和/或TCRβ基因，所述TCR和/或TCR基因减少或消除供体细胞中的功能性TCRαβ信号传导。对工程改造的CAR T细胞进行处理以除去或剔除任何剩余的未经修饰的TCRαβ阳性细胞，并且确定原料药或最终药品中任何剩余的TCRαβ阳性细胞。
[0006]应用于半定量流式细胞术的分层门控允许对异质性细胞群进行详细分析。因此，该方法经常被分析性地使用，以在制备期间或之后提供复合的工程改造的细胞疗法(诸如CAR T细胞)的CMC(化学、制备和控制)技术信息。但是，在符合cGMP(现行良好生产规范)要求的高度简化的制备环境中使用这些方法时存在挑战。挑战的来源之一是起始细胞的差异。例如，在同种异体CAR T细胞制备过程中，TCRαβ阳性率的水平因供体而不同，这使门控设置变得困难。不合适的TCRαβ门控设置可以导致TCRαβ阳性T细胞的报告不足或报告过多，这分别可能导致患者的GvHD风险增加，或者排斥合适的T细胞药品的风险增加。此外，用于TCR剔除和检测的相容性试剂可以并不总是可用。
[0007]此外，所期望的是，以适合高度简化的商业制备环境的方式确定复合的工程改造的细胞疗法(诸如CAR T药品)的其他属性。因此，需要改善的方法来分析和表征复合的细胞治疗药品在制备环境中，尤其是在GMP环境中的重要属性。


[0008]本公开涉及用于分析工程改造的免疫细胞的方法和试剂，所述免疫细胞包括包含嵌合抗原受体(CAR)的那些免疫细胞，即CAR T细胞。例如，本公开尤其涉及确定同种异体CAR T细胞药品中剩余的TCRαβ+CAR T细胞的数量或百分比的方法以及表征CAR T细胞的其他属性的方法。

技术实现思路

[0009]本公开涉及用于分析工程改造的免疫细胞的方法和试剂，所述免疫细胞包括包含嵌合抗原受体(CAR)的那些免疫细胞。
[0010]本文提供了用于在制备过程之中或之后分析和表征工程改造的免疫细胞(诸如CAR T细胞)的方法、试剂和试剂盒。例如，本文提供了用于分析所制备的CAR T细胞的效力或多功能性和/或其他属性的方法、试剂和试剂盒，所述属性包括所制备的同种异体CAR T细胞中剩余的TCRαβ+T细胞的数量或百分比。
[0011]在一个方面，本公开提供了一种分析免疫细胞群的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为在TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达，所述方法包括以下步骤：(a)从所述免疫细胞群中获得或测量活CD45+细胞；(b)从步骤(a)中所述的细胞获得或测量CD5+/CD3+细胞；(c)从步骤(b)中所述的细胞测量或确定CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量，其中步骤(c)中所述的CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量表示所述免疫细胞群中存在的TCRαβ+T细胞的百分比或数量。在一些实施方案中，所述一个或多个遗传修饰在所述TCRα基因座处。在一些实施方案中，所述一个或多个遗传修饰在TRAC基因座(TCRα链恒定区)处。
[0012]在另一个方面，本公开提供了一种测量免疫细胞群中的TCRαβ+T细胞的百分比或数量的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为在TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达，所述方法包括以下步骤：(a)从所述免疫细胞群中获得或测量活CD45+细胞；(b)从步骤(a)中所述的细胞获得或测量CD5+/CD3+细胞；以及(c)从步骤(b)中所述的细胞测量或确定CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量，其中步骤(c)中所述的CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量表示所述免疫细胞群中的TCRαβ+T细胞的百分比或数量。在一些实施方案中，所述一个或多个遗传修饰在所述TCRα基因座处。在一些实施方案中，所述一个或多个遗传修饰在TRAC基因座处。
[0013]在一些实施方案中，所述免疫细胞群已经被工程改造为表达CAR。在一些实施方案中，所述免疫细胞群是CAR T细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞群是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，所述免疫细胞群是CD4+和/或CD8+T细胞群。在一些实施方案中，TCRαβ+T细胞的百分比或数量通过从步骤(b)中所述的CD5+/CD3+细胞群减去CD3+/TCRγδ+细胞的百分比或数量来确定。在某些实施方案中，所述方法还包括测定CD3+/TCRγδ+细胞的步骤。在一些实施方案中，所述CAR T细胞是同种异体CAR T细胞。
[0014]在另一个方面，本公开提供了一种分析CAR T细胞的方法，所述方法包括在抗原刺激之后测量所述CAR T细胞的表面CD107的步骤，其中与抗原刺激前的水平相比，表面CD107的水平增加表示多功能CAR T细胞。在一些实施方案中，表面CD107的水平增加是表面CD107的百分比增加或平均值/中位数荧光强度增加。在某些实施方案中，与在相同条件下非多功能CAR T细胞相比，多功能CAR T细胞在抗原刺激之后分泌更高水平的TNFα。在某些实施方案中，与在相同条件下非多功能CAR T细胞相比，多功能CAR T细胞在抗原刺激之后分泌更高水平的IL2。在某些实施方案中，与在相同条件下非多功能CAR T细胞相比，多功能CAR T细胞在抗原刺激之后分泌更高水平的IFNγ。在一些实施方案中，所述CAR T细胞已经被工程改造为在所述TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达。在一些实施方案中，所述一个或多个遗传修饰在所述TCRα基因座处。
在一些实施方案中，所述方法不需要测量一种或多种效应细胞因子的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括测量一种或多种细胞因子的步骤，所述细胞因子选自由以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分析免疫细胞群的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为在TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达，所述方法包括以下步骤：a)从所述免疫细胞群中获得或测量活CD45+细胞；b)从步骤a)中所述的细胞获得或测量CD5+/CD3+细胞；以及c)从步骤b)中所述的细胞测量或确定CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量，其中步骤c)中所述的CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量表示所述免疫细胞群中存在的TCRαβ+T细胞的百分比或数量。2.一种测量免疫细胞群中的TCRαβ+T细胞的百分比或数量的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为在TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达，所述方法包括以下步骤：a)从所述免疫细胞群中获得或测量活CD45+细胞；b)从步骤a)中所述的细胞获得或测量CD5+/CD3+细胞；以及c)从步骤b)中所述的细胞测量或确定CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量，其中步骤c)中所述的CD3+/TCRγδ
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细胞的百分比或数量表示所述免疫细胞群中的TCRαβ+T细胞的百分比或数量。3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为表达嵌合抗原受体(CAR)。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞群是外周血单核细胞(PBMC)或者CD4+和/或CD8+T细胞群。5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TCRαβ+T细胞的百分比或数量通过从步骤b)中所述的CD5+/CD3+细胞群减去CD3+/TCRγδ+细胞的百分比或数量来确定。6.一种分析免疫细胞群的方法，所述免疫细胞群已经被工程改造为表达CAR，所述方法包括在抗原刺激之后测量所述CAR T细胞的表面CD107的步骤，其中与抗原刺激前的水平相比，表面CD107的水平增加表示多功能CAR T细胞。7.如权利要求6所述的方法，其中所述表面CD107的水平增加是表面CD107的百分比增加或平均值/中位数荧光强度增加。8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中与非多功能CAR T细胞相比，所述多功能CAR T细胞在抗原刺激之后分泌更高水平的TNFα。9.如权利要求6至权利要求8中任一项所述的方法，其中所述CAR T细胞已经被工程改造为在所述TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达。10.如权利要求6至权利要求9中任一项所述的方法，还包括测量一种或多种细胞因子，所述细胞因子选自由以下各项组成的组：INFγ、TNFα、IL2、GM
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CSF、CXCL1、IL
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1b、IL
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2、IL
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4、IL
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5、IL
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6、IL
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7、IL
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8、IL
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9、IL
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10、IL
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12、IL
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17、IL
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21、IL
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22、IL
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23、CXCL11、Mip1a、Mip1b、Mip3a、TNFb、穿孔素、粒酶A、粒酶B、粒酶H、CCL11、IP
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10、CCL5、TGFb、sCD137、sCD40L、MCP
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1和MCP
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4。11.如权利要求6至权利要求10中任一项所述的方法，其中所述CAR T细胞通过将所述CAR T细胞与表达所述CAR的抗原的靶细胞共培养来刺激。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述靶细胞是肿瘤细胞。13.如权利要求6至权利要求12中任一项所述的方法，其中所述表面CD107的水平通过流式细胞术来测量。14.如权利要求6至权利要求13中任一项所述的方法，其中CD107是CD107a和/或CD107b。15.如权利要求6至权利要求14中任一项所述的方法，其中CD107在抗原活化之后约6小时测量。16.一种分析免疫细胞群的方法，其中所述免疫细胞群已经被工程改造为在TCRα和/或TCRβ基因座处引入一个或多个遗传修饰，所述遗传修饰减少或削弱TCRαβ表面表达，并且其中所述淋巴细胞群已经被工程改造为表达嵌合抗原受体(CAR)，所述方法包括以下步骤：a)如权利要求1或权利要求2所述的方法测量或确定所述免疫细胞群中的TCRαβ+T细胞的百分比或数量；以及b)在所述免疫细胞群中测量...

【专利技术属性】
技术研发人员：L，
申请(专利权)人：艾洛基治疗公司，
类型：发明
国别省市：