用于保护治疗性细胞免于发生同种异体排斥和激活诱导的细胞死亡的FasL表达和FasR基因敲除制造技术

用于改善疗法的组合物、方法、表达载体和经工程化的免疫细胞，所述疗法需要向患者施用同种异体细胞。一种免疫细胞，例如T细胞，所述细胞被修饰以包括和/或表达来自例如表达载体的FasL蛋白或FasL蛋白衍生物，所述表达载体包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸，并且以在降低水平下表达FasR，并且被进一步修饰以包括和/或表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)。一种改善的CAR T细胞治疗方法，所述方法包括施用改善的免疫细胞以及包括所述改善的免疫细胞的组合物。改善施用的细胞的持久性和减少激活诱导的细胞死亡的方法，所述方法包括施用所述改善的细胞。方法包括施用所述改善的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于保护治疗性细胞免于发生同种异体排斥和激活诱导的细胞死亡的FasL表达和FasR基因敲除
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于2021年3月4日提交的美国临时申请第63/156,902号的优先权权益，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2022年2月24日的所述ASCII副本命名为AT
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040_02WO_SL.txt并且大小为102,560字节。


[0005]本公开总体上涉及经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞(例如，T细胞)在治疗疾病中的用途。

技术介绍

[0006]靶向细胞疗法采用基因工程化以用癌症靶向受体(T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))武装免疫效应细胞并且然后将这些经工程化的细胞注入到自体或同种异体癌症患者体内。经基因修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移已成为治疗癌症的有效方法(参见例如，Brenner等人,《免疫学新见(Current Opinion in Immunology)》,22(2):251
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257(2010)；Rosenberg等人,《自然综述：癌症(Nature Reviews Cancer)》,8(4):299
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308(2008))。可以对免疫细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，即包括抗原识别部分和T细胞激活结构域的融合蛋白(参见例如，Eshhar等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720
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724(1993)以及Sadelain等人,《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol)》,21(2):215
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223(2009))。将含有CAR的免疫细胞，例如CAR
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T细胞(CAR
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T)工程化以在保持或增强其识别和杀伤靶细胞的能力的同时赋予其抗原特异性。
[0007]然而，CAR修饰的自体细胞疗法的产生是昂贵的，需要数周的过程和质量测试，并且根据所采用的患者特异性T细胞的初始质量和数量产生不同效力的产物。相对于自体疗法，同种异体CAR修饰的细胞疗法——其中来自健康供体的细胞用CAR修饰，并且然后施用于多个患者——有望成为可以在需要时立即提供的更便宜并且更强大的产物(参见例如，Graham等人,《细胞(Cells)》2018,7,155；doi:10.3390/cells7100155)。另外地，同种异体疗法能够选择期望的产物特性(例如，基因编辑效率、整合位点、缺乏有害的脱靶基因编辑、单体型等)，并且促进更复杂的细胞工程化(例如，多个基因编辑改善效力、持久性、归巢等)。实施同种异体CAR修饰的细胞疗法的关键障碍是患者(宿主)的免疫系统对产物(供体)的潜在排斥。
[0008]可替代地，并且像自体细胞疗法一样，渗入肿瘤微环境的同种异体效应细胞随时间屈服于激活诱导的细胞死亡(AICD)，从而限制了治疗持久性。
[0009]虽然同种异体细胞疗法比自体细胞疗法有许多优点，但同种异体细胞也面临宿主
或接受者免疫系统细胞的排斥，所述免疫系统细胞与不同于宿主的同种异体细胞产物的表面上的T和NK表位决定簇具有反应性。本公开提供了改善的同种异体疗法的优点，其提供了所施用细胞的增加的持久性，而不管接受者的天然防御。

技术实现思路

[0010]本公开提供了一种反击策略，通过所述策略，受体修饰的细胞疗法产物(例如，免疫细胞例如经工程化以表达抗原结合蛋白例如CAR的T细胞)在两个方面被进一步基因工程化。首先，将细胞工程化成异源表达Fas配体(也称为FasL或CD178)蛋白或其来自编码所述蛋白的核酸的衍生物。第二，对细胞进行基因修饰，使得Fas受体(也称为Fas、FasR或CD95)基因的表达水平降低(例如通过敲除消除)。FasL的表达使得产物细胞在激活时杀伤表达FasR的同种异体反应性宿主T细胞和自然杀伤(NK)细胞，因为FasL的FasR结合触发表达FasR的细胞中的凋亡。降低细胞的FasR表达水平(例如，消除细胞中的FasR表达)保护产物细胞免于发生FasL诱导的自相残杀和AICD。
[0011]除了其它方面，本公开还提供了用于改善需要向患者施用同种异体细胞的疗法的组合物、方法和相关材料，例如表达载体、经工程化的细胞和组合物。本公开的一方面是免疫细胞，例如经修饰以使得其包括和/或表达FasL蛋白或FasL蛋白衍生物(例如，来自包括编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸的表达载体)的T细胞。本公开的第二方面是免疫细胞，例如经修饰以使得其在降低水平下表达FasR的T细胞(例如，通过使用任何基因突变或基因编辑技术基因修饰细胞)。在这两个方面的实施例中，进一步修饰免疫细胞，例如T细胞以使得其包括和/或表达抗原结合蛋白，例如嵌合抗原受体(CAR)(例如来自包括编码抗原结合蛋白例如CAR的多核苷酸的表达载体)。在一些实施例中，免疫细胞例如T细胞包括这些修饰中的两种或三种。因此，例如，本公开提供了一种CAR T细胞疗法的改善方法，所述方法包括施用免疫细胞，例如已经修饰以表达抗原结合蛋白例如CAR，表达水平降低的FasR或完全不表达FasR(例如FasR敲除)，以及表达FasL蛋白或FasL衍生蛋白的T细胞。因此，本公开进一步提供了一种CAR T细胞疗法的改善方法，其中相对于经修饰仅表达抗原结合蛋白例如CAR的施用细胞，AICD减少和/或持久性例如包括三种修饰的施用细胞的治疗持久性增加。
[0012]一方面，本文提供了一种载体，所述载体包括编码抗原结合蛋白的第一多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的第一多核苷酸。在实施例中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在实施例中，所述FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的氨基酸序列由以下组成或包括以下：UniprotKB
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P48023(野生型人FasL，SEQ ID NO:3)、人FasLδ2
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74(SEQ ID NO:7)、人FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、人FasL C82A(SEQ ID NO:8)或人FasL SLEKQ126
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>EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。
[0013]在实施例中，载体进一步包括编码重组抗原受体的多核苷酸与编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸之间的编码2A肽的序列(SEQ ID NO:2)和/或包括转录后调节元件(PRE)例如WPRE。在实施例中，所述载体是病毒载体例如慢病毒载体。
[0014]另一方面，本文提供了一种经工程化的免疫细胞，所述经工程化的免疫细胞包括本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种载体，其包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸。2.根据权利要求1所述的载体，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。3.根据权利要求1至2中任一项所述的载体，其中所述FasL蛋白或FasL蛋白衍生物包括UniprotKB
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P48023(SEQ ID NO:3)、FasLδ2
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74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)或FasL SLEKQ
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>EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的载体，其中所述载体进一步包括编码重组抗原受体的多核苷酸与所述编码FasL蛋白或FasL蛋白衍生物的多核苷酸之间的编码2A肽的序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。6.一种经工程化的免疫细胞，其包括根据权利要求1至5中任一项所述的载体。7.根据权利要求6所述的经工程化的免疫细胞，与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞进一步包括水平降低的FasR表达。8.根据权利要求6所述的经工程化的免疫细胞，其中与未经基因修饰以在降低水平下表达FasR的经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞已被基因修饰以在降低水平下表达FasR。9.一种经工程化的免疫细胞，其包括抗原结合蛋白和FasL或FasL衍生物，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞进一步包括水平降低的FasR表达。10.一种经工程化的免疫细胞，其包括抗原结合蛋白和FasL或FasL衍生物，其中与未经基因修饰以在降低水平下表达FasR的经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞已被基因修饰以在降低水平下表达FasR。11.根据权利要求8或权利要求10所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞使用TALEN、CRISPR/Cas9和megaTAL核酸酶中的任一种进行基因修饰，或表现出使用例如shRNA或微RNA实现的降低的表达水平。12.根据权利要求9至11中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。13.根据权利要求6至12中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中FasL或FasL衍生物选自由以下组成的组：野生型FasL(SEQ ID NO:3)、FasLδ2
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74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)和FasL SLEKQ
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>EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)。14.根据权利要求6至13中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中所述经工程化的免疫细胞表现出相对于第二经工程化的免疫细胞改善的体内持久性，其中所述第二经工程化的免疫细胞包括分离的T细胞的所有组分，除了所述第二经工程化的免疫细胞不包括病毒蛋白之外。15.一种经工程化的免疫细胞，其包括编码抗原结合蛋白的多核苷酸和编码FasL或FasL衍生物的多核苷酸，其中与未经工程化的免疫细胞相比，所述经工程化的免疫细胞包括降低的FasR表达。16.根据权利要求15所述的经工程化的免疫细胞，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。
17.根据权利要求15至16中任一项所述的经工程化的免疫细胞，其中FasL或FasL衍生物选自由以下中提供的序列编码的氨基酸序列组成的组：UniprotKB P48023(SEQ ID NO:3)、FasL、FasLδ2
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74(SEQ ID NO:7)、FasL Q130D(SEQ ID NO:10)、FasL C82A(SEQ ID NO:8)和FasL SLEKQ
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>EEAAA(SEQ ID NO:9)(“SLEKQ”和“EEAAA”分别公开为SEQ ID NO:32和33)。18.根据权利要求6至17中任一项所述的经工程化的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：艾洛基治疗公司，
类型：发明
国别省市：