【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转导免疫细胞的方法
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请主张2021年1月28申请的美国临时申请第63/142,730号;和2022年1月24日申请的美国临时申请第63/302,225号的优先权,所述两个临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
[0003]本公开涉及用逆转录病毒载体转导免疫细胞,例如T细胞以表达基因产物,例如嵌合抗原受体(CAR)基因产物的方法。
技术介绍
[0004]在过继性细胞疗法中,自体和同种异体免疫细胞可以经遗传修饰以表达使得细胞能够执行新治疗功能的合成蛋白质。免疫细胞可以经基因工程改造以表达嵌合抗原受体(“CAR”),即包含抗原识别部分和T细胞活化结构域的融合蛋白。含有CAR的经工程改造的免疫细胞,例如CAR
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T细胞(“CAR
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T”)具有抗原特异性和保持或增强的识别并杀伤靶细胞,例如癌细胞的能力。免疫细胞可通过转导进行工程改造,其中将编码CAR的核酸经由病毒载体引入免疫细胞中。先前的为了CAR T免疫疗法转导免疫细胞,特别是以制造规模转导同种异体免疫细胞的方法可能会效率低下,产生不一致的结果且通常使用提高加工成本和复杂性的试剂。
[0005]因此,仍需要一种产生CAR
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T细胞的方法,其中免疫细胞转导效率稳定且一致,并且比当前方法更简单且更便宜。
技术实现思路
[0006]本文描述用病毒载体转导免疫细胞从而提供经遗传修饰的免疫细胞群体的改进方法,所述经遗传修饰的免疫细胞群体具有较 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用逆转录病毒载体转导细胞群体的方法,所述载体包含对于所述细胞为外源性的核酸,所述方法包含:a)选择所述细胞群体,其中所选择的细胞群体包含T淋巴细胞、辅助T细胞、肿瘤细胞、记忆T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、外周血淋巴细胞、外周血单核细胞、树突状细胞或自然杀伤细胞或其混合物;和b)在细胞培养基中,在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养,并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内,以产生经转导细胞群体,所述经转导细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞。2.根据权利要求1所述的方法,其中所述起始pH维持在所述起始pH范围内,保持至少约1、约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。3.根据权利要求1所述的方法,其中将所述起始pH维持在高于约7.0,直至转导培养步骤结束。4.根据权利要求3所述的方法,其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞培养基不包含共定位剂。6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞培养基不包含纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所选择的细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所选择的细胞群体在容器中培养,其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室(cell stack)、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。10.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所选择的细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中在转导培养步骤起始之后约3至约18天,至少约35%至约95%、约40%至约95%、约50%至约95%、约60%至约95%或约70%至约95%的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中在转导培养步骤起始之后约7至约18天,至少约35%至约95%、约40%至约95%、约50%至约95%、约60%至约95%或约70%至约95%的经转导细胞群体表达外源性核酸基因产物。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所述起始pH范围被动地维持。15.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的方法,其中所述起始pH范围主动地维持。16.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中所选择的细胞群体为同种异体细胞群体。17.根据权利要求1至15中任一权利要求所述的方法,其中所选择的细胞群体为自体细胞群体。18.一种转导第一和第二细胞群体的方法,其中所述第一和第二细胞群体通过根据前述权利要求中任一权利要求所述的相同方法转导,由此第一和第二经转导细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞群体的百分比不会相差超过约2%至约5%、约5%至约10%、约10%至约20%或约20%至约30%。19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法,其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE
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葡聚糖。21.一种用逆转录病毒载体转导细胞毒性T细胞群体的方法,所述载体包含对于所述细胞毒性T细胞为外源性的核酸,所述方法包含在细胞培养基中,在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养,并在转导培养步骤的至少第一个小时内将所述起始pH维持在所述起始pH范围内,以产生经转导细胞毒性T细胞群体,所述经转导细胞毒性T细胞群体包含表达由所述外源性核酸编码的基因产物的细胞,且其中所述细胞培养基不包含共定位剂。22.根据权利要求21所述的方法,其中所述起始pH维持在7.0至7.9的起始pH范围内,保持至少约1、约2、约6、约8、约10、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时至不超过约168小时。23.根据权利要求21所述的方法,其中将所述起始pH维持在所述起始pH范围内,直至转导培养步骤结束。24.根据权利要求23所述的方法,其中转导培养步骤进行至少约1、约2、约4、约6、约8、约12、约14、约16、约18、约20、约22、约24、约36、约48、约72或约96小时。25.根据前述权利要求21至24中任一权利要求所述的方法,其中所述共定位剂为纤维连接蛋白或纤维连接蛋白衍生物。26.根据前述权利要求21至25中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞毒性T细胞群体以约0.25、约0.5、约1、约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约或约50至约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约125、约150、约175、约200、约225或约250的MOI培养。27.根据前述权利要求21至26中任一权利要求所述的方法,其中所述外源性核酸编码嵌合抗原受体。28.根据前述权利要求21至27中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞毒性T细胞群体在容器中培养,其中所述容器是细胞培养板、细胞培养深孔板、细胞培养室、受控生物反应器、摇瓶或透气袋。
29.根据前述权利要求21至28中任一权利要求所述的方法,其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。30.根据前述权利要求21至29中任一权利要求所述的方法,其中转导培养步骤包含在约0.5升体积至约10升体积的细胞培养基中将所述细胞毒性T细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养。31.根据前述权利要求21至30中任一权利要求所述的方法,其中在转导培养步骤起始之后3至18天,35%至约95%、约40%至约95%、约50%至约95%、约60%至约95%或约70%至约95%的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。32.根据前述权利要求21至31中任一权利要求所述的方法,其中在转导培养步骤起始之后7至18天,35%至约95%、约40%至约95%、约50%至约95%、约60%至约95%或约70%至约95%的经转导细胞毒性T细胞群体表达外源性核酸基因产物。33.根据前述权利要求21至32中任一权利要求所述的方法,其中所述起始pH范围被动地维持。34.根据权利要求21至32中任一权利要求所述的方法,其中所述起始pH范围主动地维持。35.根据前述权利要求21至34中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞毒性T细胞群体为同种异体细胞毒性T细胞群体。36.根据权利要求21至34中任一权利要求所述的方法,其中所述细胞毒性T细胞群体为自体细胞毒性T细胞群体。37.一种转导第一和第二细胞毒性T细胞群体的方法,其中所述第一和第二细胞毒性T细胞群体通过根据前述权利要求21至36中任一权利要求所述的方法转导,由此第一和第二经转导细胞毒性T细胞群体中表达外源性核酸基因产物的经转导细胞毒性T细胞群体的百分比不会相差超过约2%至约5%、约5%至约10%、约10%至约20%或约20%至约30%。38.根据前述权利要求21至37中任一权利要求所述的方法,其中没有向所述细胞培养基中添加聚阳离子。39.根据前述权利要求21至38中任一权利要求所述的方法,其中没有向所述培养基中添加聚凝胺、硫酸鱼精蛋白或DEAE
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葡聚糖。40.一种用逆转录病毒载体转导外周血单核细胞群体的方法,所述载体包含对于所述外周血单核细胞为外源性的核酸,所述方法包含在细胞培养基中,在7.0至7.9的起始pH范围内的起始pH下将所述外周血单核细胞群体与所述逆转录病毒载体一起培养,并在转导培养步骤的...
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