工程化巨噬细胞RAW-IL10及其在肺纤维化治疗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了工程化巨噬细胞RAW

【技术实现步骤摘要】
工程化巨噬细胞RAW
‑
IL10及其在肺纤维化治疗中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医学领域，具体涉及一种工程化巨噬细胞RAW
‑
IL10及其在肺纤维化治疗中的应用。

技术介绍

[0002]肺纤维化是一种由多种病因引起的，以巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞在肺泡的堆积，以及纤维结缔组织的发展为主要特点，并最终导致患者正常肺组织结构改变的一种慢性进行性肺间质疾病。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难(自觉气不够用)，且随着病情和肺部损伤的加重，患者呼吸功能不断恶化。
[0003]白细胞介素10(IL
‑
10)主要来源于单核巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞等，在机体中发挥抑制炎症或免疫反应的作用，作为抑制性细胞因子，IL
‑
10在多种动物模型中表现出抑制纤维化的作用,这使其成为肺纤维化极具吸引力的治疗候选药物,但是IL
‑
10非常短暂的半衰期(外周血中仅1
‑
2分钟)限制了其作用的发挥。因此提高肺组织中IL
‑
10等治疗性蛋白的浓度和持续时间，成为治疗肺纤维化急需解决的关键问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种工程化巨噬细胞RAW
‑
IL10及其在肺纤维化治疗中的应用。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一种制备表达IL
‑
10蛋白的巨噬细胞的方法。
[0006]本专利技术所要求保护的制备表达IL
‑
10蛋白的巨噬细胞的方法，可包括如下步骤：使巨噬细胞表达IL
‑
10蛋白，得到表达IL
‑
10蛋白的巨噬细胞。
[0007]在所述方法中，使巨噬细胞表达IL
‑
10蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有编码IL
‑
10蛋白的基因的重组载体实现的。
[0008]其中，所述IL
‑
10蛋白为鼠源IL
‑
10,记为mIL
‑
10蛋白。
[0009]进一步地，所述mIL
‑
10蛋白可为如下任一：
[0010](A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1
‑
178位所示的蛋白质；
[0011](A2)将(A1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0012](A3)与(A1)
‑
(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
[0013](A4)在(A1)
‑
(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
[0014]上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein
‑
tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
[0015]上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性
检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0016]上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
[0017]在上述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。
[0018]相应地，所述方法可包括如下步骤：
[0019](B1)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，培养，获得重组慢病毒；
[0020](B2)将步骤(B1)得到的重组慢病毒感染巨噬细胞，从而获得表达IL
‑
10蛋白的巨噬细胞。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体为将IL
‑
10蛋白的编码基因插入到载体pCDH
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MSCV
‑
MCS
‑
EF1α
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GFP
‑
T2A
‑
Puro的多克隆位点(BamH1和Not1)之间后得到的重组质粒。
[0022]在本专利技术的具体实施方式中，所述慢病毒包装质粒为pMD2G和psPAX2。所述慢病毒包装细胞为293FT细胞。
[0023]在本专利技术的具体实施方式中，所述巨噬细胞为RAW264.7细胞。
[0024]在上述方法中，所述IL
‑
10蛋白的编码基因可为如下任一：
[0025](C1)SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1
‑
534位所示的DNA分子；
[0026](C2)在严格条件下与(C1)限定的DNA分子杂交且编码所述mIL
‑
10蛋白的DNA分子；
[0027](C3)与(C1)
‑
(C2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述mIL
‑
10蛋白的DNA分子。
[0028]上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备表达IL
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10蛋白的巨噬细胞的方法，包括如下步骤：使巨噬细胞表达IL
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10蛋白，得到表达IL
‑
10蛋白的巨噬细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法中，使巨噬细胞表达IL
‑
10蛋白是通过向巨噬细胞中导入含有IL
‑
10蛋白的编码基因的重组载体实现的。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述IL
‑
10蛋白为鼠源IL
‑
10,记为mIL
‑
10蛋白；进一步地，所述mIL
‑
10蛋白为如下任一：(A1)氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第1
‑
178位所示的蛋白质；(A2)将(A1)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；(A3)与(A1)
‑
(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；(A4)在(A1)
‑
(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘慧莹，杨翠平，张硌，柏长青，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第八医学中心，
类型：发明
国别省市：