糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路相关基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路相关基因的应用。本发明专利技术通过敲低或敲除糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白生物合成通路相关基因，构建相应的细胞系，提高了不同冠状病毒的繁殖效率，可应用于冠状病毒临床毒株的分离和培养、毒种繁殖制备、弱毒疫苗生产、抗病毒药物的筛选、病毒感染复制机理研究。复制机理研究。

【技术实现步骤摘要】
糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路相关基因的应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路相关基因的应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒属于尼多病毒目冠状病毒科，包含4个属，分别为阿尔法、贝塔、伽马和德尔塔四个属，其中属于贝塔冠状病毒属的SARS
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CoV、MERS
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CoV、SARS
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CoV
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2是本世纪暴发的三次冠状病毒疫情的病原体，给人类健康和社会经济带来了巨大的损失；属于阿尔法冠状病毒属的PEDV、SADS
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CoV、TGEV和德尔塔冠状病毒属的PDCoV主要感染猪群的消化道，给养猪业带来了巨大的经济损失；而属于阿尔法冠状病毒属的HCoV
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NL63、HCoV
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229E和属于贝塔冠状病毒属的HCoV
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OC43与HCoV
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HKU1是引起常规感冒的主要病原体。
[0003]病毒是严格的细胞内寄生生物，在感染宿主细胞的过程中会利用宿主细胞的翻译等机制进行病毒的复制，在这个过程中病毒与宿主细胞会发生各种相互作用，宿主细胞会拮抗病毒的复制，产生抗病毒宿主因子，同时病毒也会拮抗宿主的抗病毒机制，逃逸宿主的拮抗作用，产生促病毒宿主因子。
[0004]糖基磷脂酰肌醇或糖磷脂酰肌醇，即GPI，它是一种磷酸甘油酯，其生物合成是一种重要的保守于真核生物中的蛋白质翻译后修饰过程，尽管不同生物间的合成转运过程会稍有不同，但总体大同小异。GPI锚定蛋白在内质网中合成，经过高尔基体最终表达在细胞膜表面，在转运过程中，脂质和聚糖结构在内质网和高尔基体中被进一步加工，部分成熟的GPI锚定蛋白被转运到细胞膜表面后，GPI部分会被裂解酶识别并切割，导致该GPI锚定蛋白从细胞膜表面释放。研究发现GPI生物合成至少需要23个步骤，包括33个基因参与正确的GPI锚定蛋白生物合成。
[0005]到目前为止，尚未有报道GPI生物合成途径相关基因与增强任何冠状病毒乃至其它病毒的细胞感染之间的关联性。
[0006]不同冠状病毒的感染研究离不开宿主细胞。但目前可以用于不同冠状病毒的感染的敏感细胞较少，且多面临病毒感染复制效率低下、病毒培养的滴度较低等难题，这为冠状病毒临床毒株的分离和培养、毒种繁殖制备、弱毒疫苗生产、抗病毒药物的筛选、病毒感染复制机理研究等带来不便或者研发成本高。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白合成通路相关基因的应用。本专利技术提供了一种增强冠状病毒细胞感染效率的方法。本专利技术获得了敲低或敲除糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白生物合成途径相关基因的细胞系，增强冠状病毒的感染复制，可显著提高临床毒株分离成功率；提高毒种的培养和繁殖效率；增强疫苗生产产量；利于抗病毒药物筛选效率；有助于冠状病毒感染复制机理研究。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0009]本专利技术提供了基因的敲除或敲低在以下任意项中的应用：
[0010](I)、制备基因敲除或敲低的细胞；和/或
[0011](II)、制备提高病毒感染率的产品；和/或
[0012](III)、制备提高临床病毒株分离成功率的产品；和/或
[0013](IV)、制备提高病毒毒种的培养或繁殖效率的产品；和/或
[0014](V)、制备病毒；和/或
[0015](VI)、生产弱毒疫苗；和/或
[0016](VII)、制备用于筛选抗病毒药物的产品；和/或
[0017](VIII)、研究病毒感染复制机理；和/或
[0018](IX)、建立重组病毒感染动物模型；
[0019]所述基因包括糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因；
[0020]所述糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因包括PIGA、PIGC、PIGH、PIGP、PIGQ、PIGY、DPM2、PIGL、PIGW、PIGM、PIGX、PIGV、PIGN、PIGB、PIGZ、PIGO、PIGF、PIGG、PIGF、PIGK、PIGT、PIGS、PIGU、GPAA1、PGAP1、PGAP5、PGAP3、PGAP2、PGAP4、B3GALT4、GPLD1、PGAP6或GDPD5中的任意一种或多种；
[0021]所述病毒包括冠状病毒。
[0022]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述冠状病毒包括阿尔法冠状病毒属病毒、贝塔冠状病毒属病毒、伽马冠状病毒属病毒或德尔塔冠状病毒属病毒中的任意一种或多种。
[0023]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述冠状病毒包括但不限于SARS
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CoV、MERS
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CoV、SARS
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CoV
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2、HCoV
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NL63、HCoV
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229E、HCoV
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OC43、PEDV、SADS
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CoV、IBV或PDCoV。
[0024]本专利技术还提供了基因敲除或敲低的细胞，其包括糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因敲除或敲低的细胞；
[0025]所述糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因包括PIGA、PIGC、PIGH、PIGP、PIGQ、PIGY、DPM2、PIGL、PIGW、PIGM、PIGX、PIGV、PIGN、PIGB、PIGZ、PIGO、PIGF、PIGG、PIGF、PIGK、PIGT、PIGS、PIGU、GPAA1、PGAP1、PGAP5、PGAP3、PGAP2、PGAP4、B3GALT4、GPLD1、PGAP6或GDPD5中的任意一种或多种。
[0026]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因包括PIGA、PIGV或GPAA1中的任意一种或多种。
[0027]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述PIGA具有如SEQ ID NO.4所示的核酸序列；
[0028]所述PIGV具有如SEQ ID NO.5所示的核酸序列；
[0029]所述GPAA1具有如SEQ ID NO.6所示的核酸序列。
[0030]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成通路相关基因的来源包括人、猪或非洲绿猴中的任意一种或多种。
[0031]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述细胞包括哺乳动物细胞。
[0032]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述哺乳动物细胞包括HeLa、A549
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ACE2、Calu
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3或Caco
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2中的任意一种或多种。
[0033]本专利技术还提供了所述细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0034]步骤1、将靶向敲除或敲低基因的sgRNA与慢病毒载体连接，获得靶向敲除或敲低糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
NO.2或SEQ ID NO.3所示的核酸序列。9.如权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒载体包括lentiCRISPRv2。10.如权利要求7至9任一项所述的制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：张荣，马艳龙，冯飞，马雪，韩雨桐，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：