用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型及构建方法技术

本申请公开了一种用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型及构建方法，属于细胞工程技术领域。本申请细胞模型通过同源重组质粒与Cas9

【技术实现步骤摘要】
用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型及构建方法


[0001]本申请属于细胞工程
，尤其涉及一种用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型及构建方法。

技术介绍

[0002]筛选促进心肌细胞增殖的分子和方法是加强心脏修复的有效手段。
[0003]目前，通过胚胎干细胞定向诱导心肌细胞能够分化产生具备一定增殖能力的心肌细胞，该些分化来源的心肌细胞在形态，电生理、代谢等方面高度类似于新生个体的心肌细胞，使得胚胎干细胞源心肌细胞能够作为探究新生个体心肌细胞再生分子机制的合适模型。
[0004]但是，现有体外诱导分化技术产生的心肌细胞中通常包含心肌成纤维细胞和内皮细胞等杂质细胞，使得心肌细胞的增殖研究面临很大干扰。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型及构建方法，旨在解决现有体外诱导分化技术产生的心肌细胞中包含杂质细胞，以及杂质细胞干扰心肌细胞增殖研究的技术问题。
[0006]为了实现上述目的，本申请的技术方案是：
[0007]本申请的第一方面提供一种用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型，所述细胞模型通过同源重组质粒与Cas9
‑
gRNA共转染形成；
[0008]所述同源重组质粒包括零背景载体；
[0009]所述零背景载体携载有针对Slc8a1基因敲入位点的左臂序列和右臂序列，所述左臂序列和右臂序列之间插入有T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因序列；
[0010]所述左臂序列为SEQ ID NO:1所示；
[0011]所述右臂序列为SEQ ID NO:2所示；
[0012]所述T2A基因序列为SEQ ID NO:3所示；
[0013]所述嘌呤霉素抗性基因序列为SEQ ID NO:4所示；
[0014]所述Slc8a1gRNA基因序列为SEQ ID NO:5所示。
[0015]本申请的第二方面还提供第一方面所述细胞模型的构建方法，所述方法包括：
[0016]S101：从胚胎干细胞基因组中扩增出左臂序列和右臂序列；
[0017]S102：将所述左臂序列与所述T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因PCR融合并装入零背景载体，转化感受态大肠杆菌之后，依次进行菌落培养、测序筛选和克隆扩增，获得载体质粒；
[0018]S103：对所述载体质粒进行单酶切并回收线性化的质粒片段，将所述右臂序列连接入所述线性化的质粒片段，转化感受态大肠杆菌之后，依次进行菌落培养和测序比对，获得同源重组质粒；
[0019]S104：将含有所述同源重组质粒、PX330
‑
gRNA的Cas9质粒和转染试剂的电转混合
液共同电转于预处理胚胎干细胞之后，接种至含有嘌呤霉素的培养基中进行筛选培养和常规培养，挑选单克隆进行鉴定，获得具备T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因的细胞克隆。
[0020]在第二方面可选的实现方式中，通过含有氨苄青霉素抗性的平板培养基对所述感受态大肠杆菌进行培养，其中，培养温度为37℃，培养时间大于12h。
[0021]在第二方面可选的实现方式中，通过ECORI对所述载体质粒进行单酶切。
[0022]在第二方面可选的实现方式中，所述预处理胚胎干细胞的制备方法包括：
[0023]将胚胎干细胞培养至细胞融合度为90％之后，消化为单细胞并挑取3
×
105细胞用PBS清洗两遍，去除残余培养基，获得细胞沉淀，即为预处理胚胎干细胞。
[0024]在第二方面可选的实现方式中，所述转染试剂为NucleofectorSolution和Supplement的混合试剂。
[0025]在第二方面可选的实现方式中，所述电转混合液包括：
[0026]10μg的同源重组质粒、5μg的PX330
‑
gRNA的Cas9质粒、16.4μL的NucleofectorSolution和3.6μL的Supplement。
[0027]在第二方面可选的实现方式中，所述含有嘌呤霉素的培养基中的嘌呤霉素浓度为1ng/mL。
[0028]在第二方面可选的实现方式中，所述筛选培养的时间为48h。
[0029]在第二方面可选的实现方式中，所述常规培养的时间为7天，并且每天更换一次培养基。
[0030]与现有技术相比，本申请的优点或有益效果至少包括：
[0031]本申请第一方面提供的细胞模型包括Slc8a1位点插入T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因的基因片段，使得该细胞模型进行心肌细胞分化之后可以基于嘌呤霉素的筛选作用有效筛除心肌细胞中的杂质细胞，实现体外分化来源心肌细胞的纯化与分离，防止杂质细胞对心肌细胞的增殖研究产生干扰，为体外心肌细胞的增殖筛选提供了有效的细胞平台，在药物开发方面有很好的应用前景。其中，Slc8a1能够编码产生钠钙交换蛋白NCX1，钠钙交换蛋白NCX1能够在心肌细胞中特异性表达，用于筛选心肌细胞具有高效、可控的优点；此外，T2A的存在可以使翻译形成的NCX1和抗嘌呤霉素(两个蛋白)分开并独立折叠，不影响NCX1蛋白的功能。
附图说明
[0032]为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]图1为本申请实施例提供的PCR检测T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因成功插入胚胎干细胞基因组的鉴定结果；
[0034]图2为本申请实施例提供的免疫荧光色检测实施例2分化得到的心肌细胞的纯度情况；
[0035]图3为本申请实施例提供的免疫荧光染色检测对照和过表达miR
‑
130b
‑
5p心肌细胞中Ki67(A)、pH3(B)和Auroa
‑
B(C)的比率；
[0036]图4为本申请实施例提供的Ki67、pH3和Auroa
‑
B阳性心肌细胞比率的统计结果；
[0037]图5为本申请实施例提供的Q
‑
PCR检测对照和过表达miR
‑
130b
‑
5p的心肌细胞中促增殖相关基因的表达水平；
[0038]图6为本申请实施例提供的通过小动物心脏超声检测各组小鼠心脏功能的二维超声图；
[0039]图7为本申请实施例提供的通过小动物心脏超声检测各组小鼠的射血分数(EF)；
[0040]图8为本申请实施例提供的通过小动物心脏超声检测各组小鼠的左心室缩短分数(FS)；
[0041]图9为本申请实施例提供的通过小动物心脏超声检测各组小鼠的左心室舒张末期(LVIDd)的内径大小；
[0042]图10为本申请实施例提供的通过小动物心脏超声检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于纯化分化来源心肌细胞的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型通过同源重组质粒与Cas9
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gRNA共转染形成；所述同源重组质粒包括零背景载体；所述零背景载体携载有针对Slc8a1基因敲入位点的左臂序列和右臂序列，所述左臂序列和右臂序列之间插入有T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因序列；所述左臂序列为SEQ ID NO:1所示；所述右臂序列为SEQ ID NO:2所示；所述T2A基因序列为SEQ ID NO:3所示；所述嘌呤霉素抗性基因序列为SEQ ID NO:4所示；所述Slc8a1 gRNA基因序列为SEQ ID NO.5所示。2.一种根据权利要求1所述细胞模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S101：从胚胎干细胞基因组中扩增出左臂序列和右臂序列；S102：将所述左臂序列与T2A
‑
嘌呤霉素抗性基因PCR融合并装入零背景载体，转化感受态大肠杆菌之后，依次进行菌落培养、测序筛选和克隆扩增，获得载体质粒；S103：对所述载体质粒进行单酶切并回收线性化的质粒片段，将所述右臂序列连接入所述线性化的质粒片段，转化感受态大肠杆菌之后，依次进行菌落培养和测序比对，获得同源重组质粒；S104：将含有所述同源重组质粒、PX330
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gRNA的Cas9质粒和转染试剂的电转混合液共同电转于预处理胚胎干细胞之后，接种至含有嘌呤霉素的培养基中进行筛选培养和常规...

【专利技术属性】
技术研发人员：康九红，冯可，武玉康，郭旭东，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：