细胞模型及其制备方法和应用技术

本申请涉及细胞模型及其制备方法和应用，所述制备方法包括含有YFP的基因片段定点敲入至正常细胞的p21基因的终止密码子位置，获得重组细胞后，筛选出p21

【技术实现步骤摘要】
细胞模型及其制备方法和应用


[0001]本申请涉及生物医药领域，具体涉及细胞模型及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着人类生活质量的提高，衰老问题已日渐成受到关注，研发具有抗衰老的新药既具有重大社会意义又有巨大商业价值。衰老分为个体衰老、器官衰老、细胞衰老几个水平，个体与器官的衰老最终反应在细胞衰老上，目前，缺乏一种细胞衰老模型可以高效对潜在的抗/促衰药物进行筛选。

技术实现思路

[0003]基于此，本申请有必要提供一种细胞模型，可用于高效地对潜在的抗衰老药物或促衰药物进行筛选。
[0004]具体技术方案如下：
[0005]一种细胞模型的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
[0006]采用CRISPR/Cas9系统将YFP编码基因的序列定点敲入至正常肝细胞的p21基因中，得到重组细胞；
[0007]在所述重组细胞中，筛选出p21
‑
YFP阳性细胞，获得细胞模型。
[0008]在其中一个实施例中，在所述筛选出p21
‑
YFP阳性细胞的步骤前，还包括用含有药物的培养基诱导培养所述重组细胞衰老的步骤。
[0009]可选的，所述药物包括Doxorubicin、Aphidicolin、Hydroxyurea、Etoposide、Decitabine、Trichostatin A、MS
‑
275和Palbociclib中的一种或多种。
[0010]所述制备方法制备得到的细胞模型。
[0011]所述细胞模型在制备抗衰老药物筛选系统或药物的促衰老副作用的评价系统中的应用。
[0012]一种抗衰老药物的筛选方法，所述方法包括使用上述细胞模型对候选物质进行进行抗衰老药物的筛选。
[0013]一种药物是否有促衰老副作用的评价方法，所述方法包括使用所述细胞模型对药物进行促衰老副作用的评价。
[0014]相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
[0015]本申请将包括含有YFP的基因片段定点敲入至正常细胞的p21基因的终止密码子位置，获得重组细胞后，筛选出p21
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YFP阳性细胞，可以作为促进衰老药物筛选系统使用；进一步，将重组细胞通过药物诱导衰老后，筛选出的p21
‑
YFP阳性细胞，可以作为抗衰老药物筛选系统使用。根据本申请制备方法获得细胞模型，通过检测YFP荧光快速、高效的筛选出抗衰老药物或促进衰老药物。
附图说明
[0016]图1为p21
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YFP
‑
Neo细胞系构建，(A)p21
‑
YFP
‑
Neo细胞系构建策略；(B)p21gRNA测序结果；(C)p21 donor质粒图谱；(D)电泳结果：M表示Marker，1表示p21 donor质粒，2表示经过EcoR V酶切之后的p21 donor质粒；
[0017]图2为p21
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YFP
‑
Neo单克隆细胞系鉴定；
[0018]图3为Doxorubicin诱导p21
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YFP
‑
Neo细胞系衰老浓度优化结果；
[0019]图4为p21
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YFP
‑
Neo细胞系衰老的检测，其中DMSO和Doxorubicin分别对p21
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YFP
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Neo细胞系处理之后，β
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半乳糖苷酶染色结果，荧光显微镜下观察p21
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YFP的表达；
[0020]图5为衰老药筛体系对抗衰老药物验证。
具体实施方式
[0021]为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
[0022]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
[0023]本申请所使用的术语“和/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。比如，“A和/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。
[0024]本申请中涉及“多种”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。“以上”包括本数，比如“两种以上”包括两种、三种或更多种。
[0025]本申请中，“优选”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本申请保护范围的限制。
[0026]本申请中，“进一步”、“更进一步”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。
[0027]本申请中，在“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”、“第五方面”、“第六方面”、“第七方面”中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”、
““
第五”、“第六”“第七”仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、第四”、
““
第五”、“第六”、“第七”仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
[0028]因此，第一方面，本申请一实施方式提供了一种可用于评价药物是否有促衰老副作用的细胞模型的制备方法，该方法包括如下步骤S1～S2：
[0029]步骤S1:采用CRISPR/Cas9系统将YFP编码基因的序列定点敲入至正常肝细胞的p21基因中，得到重组细胞。
[0030]具体的，p21(cyclin
‑
dependent kinase inhibitor p21，CDKN1A)是一个重要的
衰老标志物，p21是磷酸化P53的下游CDKI，通过结合CDK2阻断细胞周期进入G1/S一直细胞周期。p21的高表达与衰老相关。
[0031]本领域普通技术人员可以将YFP替换为其他的荧光蛋白，例如CFP、GFP和FFP等，均在本申请的保护范围内。
[0032]在一个具体示例中，YFP的核苷酸序列包括如SEQ.ID No.13所示的第3536～第4252位置的碱基。
[0033]在一个具体示例中，正常肝细胞可选自例如LO2细胞株，是人正常肝细胞，而非肝癌细胞系，肿瘤标志物AFP与CK
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19等表达阴性，具有典型的肝细胞形态本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞模型的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：采用CRISPR/Cas9系统将YFP编码基因的序列定点敲入至正常肝细胞系的p21基因中，得到重组细胞；在所述重组细胞中，筛选出p21
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YFP阳性细胞，获得细胞模型。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述筛选出p21
‑
YFP阳性细胞的步骤前，还包括用含有药物的培养基诱导培养所述重组细胞衰老的步骤；可选的，所述药物包括Doxorubicin、Aphidicolin、Hydroxyurea、Etoposide、Decitabine、Trichostatin A、MS
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275和Palbociclib中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述药物为Doxorubicin，所述Doxorubicin在培养基中的浓度为20nM～100nM；可选的，所述药物诱导培养的时间为1天～7天，诱导培养后更换正常培养基继续培养3天～4天。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9核酸酶和/或靶向p21基因的gRNA；可选的，所述gRNA的正向序列和反向互补序列分别如SEQ.ID No.1所示和SEQ.IDNo.2所示。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述定点敲入包括将所述CRISPR/Cas9系统和包含YFP编码基因的同源重组载体转染至所述正常肝细胞系中，得到所述重组细胞的步骤。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组载体包含如下DNA片段：5
’
端同源臂、YFP编码基因及3
’
端同源臂；所述5
’
端同源臂为位于所述p21基因的终止密码子位置到上游的长度为700bp
‑
1000bp序列，所述3
’
端同源臂为位于所述p21基因的终止密码子位置到下游的长度为700bp
‑
1000bp序列；可选的，所述5
’
端同源臂的序列为SEQ....

【专利技术属性】
技术研发人员：姬广聚，乔新龙，毕友坤，王会文，杨智广，
申请(专利权)人：源生生物科技青岛有限责任公司，
类型：发明
国别省市：