【技术实现步骤摘要】
一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T及其制备方法和应用
[0001]本专利技术属于结核病免疫治疗领域,具体涉及一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T及其制备方法和应用。
技术介绍
[0002]结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的高致死性传染病,至今仍是造成死亡人数最多的单一传染病。近年来发病率持续增加,全球每年新发病例近900万、死亡病例约200万,尽管我国在肺结核防控及诊疗方面取得了一定的成绩,但中国仍是结核病高负担国家之一。
[0003]结核病的治疗目前仍以传统的化学药物治疗为主,但结核药物在临床应用中暴露出诸多短板,例如:现行结核药物治疗周期长、易引发细菌耐药;结核药物(异烟肼、利福平等)毒副作用明显、一定程度上削弱了患者自身机体免疫力。此外Mtb这种古老的细菌寄生在宿主细胞内遇到特殊环境(营养缺乏、极端pH)会处于休眠态,这进一步减弱了传统药物的敏感性及杀伤能力。在上述要素的催化下,患者机体不能够产生足够的免疫应答与特异的免疫保护,而结核病的治愈与转归极大程度上依赖病人自身的免疫状态。
[0004]结核药物的长期使用使得耐药问题愈发严重,引发了不同种类的耐药(单耐药;多耐药;广泛耐药等),给结核病的临床治疗带来了巨大的挑战。目前应对的方式依然为传统的化学药物疗法,在治疗效果极其有限同时,又造成了极大的毒副作用。不同程度损害 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T,其特征是:所述ESAT6
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CAR
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T的保藏编号为CCTCC NO:C2022374。2.根据权利要求1所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T,其特征在于:所述ESAT6
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CAR
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T对Mtb
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ESAT6抗原特异性靶向、利用CD4
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和CD8
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联合识别并杀伤Mtb宿主细胞。3.根据权利要求1
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2任一项所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法,其特征在于:所述制备方法包括:步骤1:Mtb特异性分泌抗原ESAT6的克隆、表达、纯化与免疫;步骤2:抗ESAT6蛋白特异性单链抗体氨基酸编码序列的研制与筛选;步骤3:携带抗ESAT6蛋白单链抗体序列的慢病毒及逆转录病毒的制备;步骤4:ESAT6
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CAR
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T淋巴细胞的制备。4.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法,其特征在于,所述步骤1具体包括:(1)根据Mtb的ESAT6蛋白氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并设计引物,扩增ESAT6全长片段并插入载体pET
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22b构建重组质粒pET22b
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ESAT6,利用双酶切及测序进行鉴定;(2)将鉴定正确的重组质粒pET22b
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ESAT6转化入BL21感受态细胞中并进行IPTG诱导表达,收集诱导后菌体、超声破碎并制备蛋白样品,SDS
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PAGE电泳分析蛋白表达及表达形式,优化诱导条件后,制备样品进行Ni柱亲和层析纯化,纯化后样品经SDS
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PAGE电泳分离后,转膜并孵育His标签抗体,洗膜后孵育HRP标记的二抗,而后进行显色及曝光;(3)将鉴定正确的ESAT6重组蛋白与佐剂混合乳化,按照100μg/只的剂量经皮下多点注射免疫Balb/c小鼠,2
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3周加强免疫一次,总共5次免疫,鼠尾采血后通过ELISA检测抗体效价。5.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法,其特征在于:所述步骤2具体包括:免疫过的Balb/c小鼠无菌取脾,并制备单细胞悬液,利用半固体与液相结合的方式进行细胞融合,筛选杂交瘤细胞,通过ELISA鉴定并筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞,对符合预期的杂交瘤细胞扩大培养及冻存,并对单克隆抗体进行亚型鉴定,鉴定后将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内,以期制备大量单克隆抗体,随后收集小鼠腹水,经proteinG亲和层析得到抗体,并将相对应的杂交瘤细胞进行测序。6.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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T的制备方法,其特征在于:所述步骤3具体包括:将筛选得到的序列与病毒载体质粒相连接,并转化入宿主菌,挑取阳性克隆后进行目的序列PCR及测序,将鉴定正确的病毒重组载体连同辅助质粒共转染293T细胞,依据细胞生长状态,收集转染后293T细胞上清,将含有病毒的上清浓缩保存,以备后续实验。7.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法,其特征在于:所述步骤4具体包括:健康成人外周血分离PBMC细胞,并通过磁珠阴选分离纯化CD3
+
T细胞,终浓度为25g/mL的ConA刺激CD3
+
T细胞,激活24h后加入慢病毒进行转染得到ESAT6
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CAR
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T细胞。8.根据权利要求3所述的靶向治疗结核病的ESAT6
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CAR
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T的制备方法,其特征在于:所
述步骤4具体包括:一、人外周血CD3
+
T细胞分选及体外激活:(1)采集新鲜的EDTA抗凝全血,颠倒混匀;(2)将新鲜采集的抗凝全血用PBS按照1:1的体积比进行稀释并充分混匀;(3)将...
【专利技术属性】
技术研发人员:伊正君,付玉荣,赵荣兰,乔晋娟,李恒,孟祥英,张湘涓,徐海山,
申请(专利权)人:潍坊医学院,
类型:发明
国别省市:
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