一种单信号激活型TIL细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种将CD3与T细胞共刺激因子受体的胞内激活结构域融合并表达于肿瘤浸润T淋巴细胞或外周血游离肿瘤浸润T淋巴细胞，制备单信号激活型TIL细胞，借助TIL的肿瘤特异识别性，在不需要APC细胞辅助的情况下即可实现对肿瘤的特异识别和杀伤，有效避免了TIL细胞在肿瘤微环境下因缺乏共刺激信号而不能被激活所造成的免疫耐受，可应用于不区分癌种的抗肿瘤治疗中。抗肿瘤治疗中。抗肿瘤治疗中。

【技术实现步骤摘要】
一种单信号激活型TIL细胞的制备方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种单信号激活型TIL细胞的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤目前已经成为发达国家的主要死亡原因，发展中国家的次要死亡原因。对于肿瘤的治疗，目前主要的治疗手段包括传统的放射治疗、手术切除肿瘤、药物治疗以及新兴的肿瘤生物治疗。由于手术，放化疗在治疗中会给患者带来巨大的毒副作用，因此生物治疗凭借其显著疗效的优势成为第四种重要的肿瘤治疗模式。肿瘤生物治疗主要包括：过继细胞治疗、细胞因子治疗、肿瘤疫苗、靶向分子治疗等。
[0003]肿瘤一般具有较高的异质性，而传统CAR
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T疗法的靶点有限，严重限制了其在实体瘤中的应用。另外，虽然借助高通量测序分析的新抗原（neoantigen）疗法为解决这一难题带来曙光，但这种疗法需要经过基因测序、突变筛选、新抗原合成、制备负载新抗原的疫苗（neoVx）、新抗原反应性T细胞（neoT）的筛选扩增等诸多步骤，操作繁杂，周期很长，在实际临床应用中存在很大局限性。TIL 疗法是从实体肿瘤组织中分离纯化出能特异性抗癌的淋巴细胞，具备操作简单、制备周期短、成本低等特点。并且 TIL 可以自然靶向该患者肿瘤特异性抗原并浸润到肿瘤组织内部，通过直接接触或释放细胞因子杀伤肿瘤细胞，因此 TIL 有望解决实体肿瘤治疗中的异质性肿瘤抗原识别这一瓶颈问题。但通常，T细胞的激活不仅需 T 细胞识别表达 MHC I类分子/抗原肽的肿瘤细胞，还需抗原提呈细胞提供共刺激信号。在肿瘤微环境下，TIL常因缺乏抗原提呈细胞提供共刺激信号而不能被激活，进而造成“免疫耐受”。
[0004]因此，想要充分利用好TIL治疗肿瘤，就需要对TIL进行一定的改造，使其不仅仍可特异性识别肿瘤细胞且能够在肿瘤微环境中高效发挥杀伤作用的效应细胞，才有望从根本上解决实体肿瘤治疗难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种可在体内特异性识别肿瘤细胞并高效杀伤肿瘤细胞，避免 TIL细胞在肿瘤微环境下因缺乏共刺激信号而不能被激活所造成的“免疫耐受”的单信号激活型TIL细胞及其制备方法和应用。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：一种单信号激活型TIL细胞，在该TIL细胞表面表达融合蛋白OSAM（One Signal Activated Molecular），所述融合蛋白OSAM包括相互连接的两部分：第一部分为CD3分子，第二部分为CD28的胞内激活结构域和/或CD137的胞内激活结构域。
[0007]具体的说，所述融合蛋白OSAM为：CD3蛋白（全）连接CD28的胞内激活结构域（180~220）；或者CD3蛋白（全）连接CD137的胞内激活结构域（214~255）和CD28的胞内激活结构域（180~220）；或者CD3蛋白（全）连接CD137的胞内激活结构域（214~255）。
[0008]其中，所述CD3具体可为CD3E、CD3Z、CD3G、CD3D中的任意一种。优选为CD3Z。
[0009]优选的，所述融合蛋白OSAM具体包括：CD3Z
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CD28 融合分子，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；CD3Z
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CD137
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CD28融合分子，氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0010]其中，所述TIL细胞为肿瘤浸润T淋巴细胞或外周血游离肿瘤浸润T淋巴细胞。
[0011]进一步的，所述TIL细胞为包含敲除或敲低免疫检查点基因的T淋巴细胞。
[0012]更近一步的，所述免疫检查点包括但不限于PD1、CTLA4，BTLA，TIM3，TIGIT，TGFβ受体以及其他任意具有免疫抑制功能或与免疫抑制信号通路相关蛋白。
[0013]一种上述单信号激活型TIL细胞的制备方法，其包括如下步骤：（1）筛选CD3表达阳性的TIL细胞；（2）将CD3与CD28和/或CD137融合蛋白对应的碱基序列导入到TIL细胞，构建单信号激活型TIL细胞。
[0014]进一步的，所述步骤（2）中，构建单信号激活型TIL细胞的方法包括：1）运用慢病毒、腺病毒或腺相关病毒等任意一种将表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列转导入TIL细胞基因组；2）将表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列电击转染进入TIL细胞；3）将表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列利用脂质体纳米颗粒（LNP）或转染试剂转染进入TIL细胞；4）将表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列利用基因编辑工具（CRISPR或TALEN等）精确且稳定插入基因组；5）将CD28和/或CD137的DNA序列精确且稳定插入基因组特定位置（如CD3基因中），从而表达出完整融合蛋白；6）多种表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列可以被装在同一载体上，同时转入TIL细胞，也可以分别装载在各自不同的载体上，将多种载体混合而同时转入TIL细胞，或不混合，各自分别分批转入TIL细胞而最终将各批TIL细胞混合或序贯使用。
[0015]其中，所述基因编辑法具体包括如下步骤：（A）设计sgRNA；（B）构建供体载体：合成表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列，分别在其两端加入Cas
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sgRNA识别序列；将合成好的碱基序列连接到T载体上，转化并测序，鉴定出正确的供体质粒；（C）采用电转法将Cas
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sgRNA和供体序列导入TIL中，使供体序列定点整合到TIL细胞的基因组中。
[0016]其中，所述慢病毒感染法具体包括如下步骤：（a）合成表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列克隆至慢病毒载体骨架中，并置于EF1α的启动子下，形成质粒；（b）将步骤（a）合成的质粒、慢病毒包膜质粒和慢病毒包装质粒转入HEK293T细胞中制备慢病毒；（c）在48h和72h收集上清，超离进行浓缩；（d）浓缩后的慢病毒感染TIL细胞。
[0017]其中，所述电击转染法具体包括如下步骤：（i）改造并构建可复制型载体：利用PMC微环载体骨架，切除CMV启动子序列、多克隆位点序列和GFP序列，将合成的EF1a
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MCS
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polyAsignal
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apoSMAORI连载在载体骨架上，构建成新的载体PSAM；（ii）将表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列碱基序列克隆至PSAM载体中；（iii）将PSAM载体电转入TIL细胞中。
[0018]一种上述单信号激活型TIL细胞在制备免疫细胞治疗药物中的应用。
[0019]进一步的，所述免疫细胞治疗药物用于肿瘤治疗。
[0020]更近一步的，所述癌症包括但不限于胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌。
[0021]上述免疫细胞治疗药物应用于肿瘤治疗的效果部分或全部来源于如下机制：1）借助所述免疫细胞药物或药物组合中的单信号激活型TIL细胞对肿瘤的特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单信号激活型TIL细胞，其特征在于，TIL细胞表面表达融合蛋白OSAM，所述融合蛋白OSAM包括相互连接的两部分：第一部分为CD3分子，第二部分为CD28的胞内激活结构域和/或CD137的胞内激活结构域。2.根据权利要求1所述的单信号激活型TIL细胞，其特征在于，所述TIL细胞为肿瘤浸润T淋巴细胞或外周血游离肿瘤浸润T淋巴细胞。3.根据权利要求1所述的单信号激活型TIL细胞，其特征在于，所述TIL细胞为包含敲除或敲低免疫检查点基因的T淋巴细胞。4.一种如权利要求1~3任一项所述的单信号激活型TIL细胞的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：（1）筛选CD3表达阳性的TIL细胞；（2）将CD3与CD28和/或CD137的胞内激活结构域融合蛋白对应的碱基序列导入TIL细胞中并有效表达融合蛋白，构建单信号激活型TIL细胞。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，构建单信号激活型TIL细胞的方法包括基因编辑法、慢病毒感染法、电击转染质粒法。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述基因编辑法具体包括如下步骤：（A）设计sgRNA；（B）构建供体载体：合成表达包含融合蛋白的氨基酸信息的碱基序列，分别在其两端加入Cas
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sgRNA识别序列；将合成好的碱基序列连接到T载体上，转化并测序，鉴定出正确的供体质粒；...

【专利技术属性】
技术研发人员：武永强，叶学帅，朱玉凤，
申请(专利权)人：河北科技大学，
类型：发明
国别省市：