【技术实现步骤摘要】
增强免疫细胞持久性的方法
[0001]本专利技术属于细胞
，涉及同时敲除ZC3H12A和BCOR基因的重组免疫细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。具体涉及一种增强T细胞持久性和在体内稳定植入且具有分泌功能的T细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。
技术介绍
[0002]细胞过继治疗(Adoptive cell transfer therapy)包括嵌合抗原受体 (CAR)
‑
T和T细胞受体(TCR)
‑
T等，在肿瘤的免疫治疗中具有非常显著的效果，尤其是对于淋巴细胞白血病。
[0003]目前CAR
‑
T疗法有两个缺陷：一方面，CAR
‑
T细胞在回输之前需要对患者进行化疗预处理，否则输入的CAR
‑
T细胞不能有效扩增，但该化疗过程具有很大的毒副作用；另一方面，回输的CAR
‑
T细胞在体内的持续时间有限，很多患者会因此复发。在细胞过继治疗中，如何提高重组免疫细胞的持久性是急需解决的技术问题。
[0004]人BCOR基因(Gene ID:54880，2022年5月29日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54880)和鼠Bcor基因(Gene ID: 71458，2022年5月22日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/71458)编码细胞中转录抑制因子 BCOR。人ZC3H12A基因(Gene ID:80149，20...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组免疫细胞，其中BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除。2.根据权利要求1所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述的免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞中的一种或数种，优选T细胞或NK细胞；所述T细胞选自CD4+CD8+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、效应T细胞、抑制性T细胞、原始T细胞、记忆T细胞、γ
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δT细胞、α
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βT细胞、CD4
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CD8
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双阴性T细胞或NKT细胞中的一种或数种。3.根据权利要求1或2所述的重组免疫细胞，所述重组免疫细胞为重组T细胞，重组T细胞不含BCOR基因和ZC3H12A基因，或所述重组T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的生物学功能被抑制。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术、PROTAC技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。5.根据权利要求1
‑
4中任意一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：与未修饰或对照免疫细胞相比，BCOR基因和ZC3H12A基因的表达或功能分别地被降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。6.根据权利要求1
‑
5中任意一项所述的重组免疫细胞，所述重组免疫细胞进一步包括一种或多种用于细胞过继治疗的结构。7.根据权利要求6中所述的重组免疫细胞，所述用于细胞过继治疗的相应结构为嵌合抗原受体(CAR)结构、T细胞抗原受体(TCR)结构、基于配受体结合的受体结构或T细胞受体和抗原受体(synthetic T cell receptor and antigen receptor，STAR)。8.根据权利要求7所述的重组免疫细胞，所述抗原受体结合的抗原选自RORl、Her2、Ll
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CAM、CD4、CD5、CD8、CD19、CD20、BCMA、CD7、Clauding 18.2、GPC3、MSLN、AFP、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGFRVIII、EGP
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2、EGP
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4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMWMAA、IL
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22R
‑
α、IL
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13R
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α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1
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细胞黏附分子(CD171)、MAGE
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A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY
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ESO
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1、MART
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1、gp100、瘤胚抗原、TAG72、VEGF
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R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS
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1、c
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Met、MAGE A3、CE7、肾母细胞瘤1(WT
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1)、周期蛋白A1(CCNA1)、白细胞介素12或其他肿瘤相关抗原中的一种或数种。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述重组免疫细胞是源自哺乳动物的免疫细胞。10.根据权利要求1
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9任一所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述重组免疫细胞还含有表达用于治疗疾病的生物分子的基因。11.权利要求10所述的重组免疫细胞，其中所述表达治疗疾病的生物分子选自：细胞因子、激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段。12.权利要求10所述的重组免疫细胞，其中所述治疗疾病的生物分子选自IL
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23R蛋白、IL
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4R抗体、IFN
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α、IFN
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β、IFN
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γ、IL
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2、IL
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3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
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8、IL
‑
12、IL
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13、IL
‑
22、IL
‑
23、IL
‑
24、TNF、TNF
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α、GM
‑
CSF、CD40L、CTLA
‑
4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1中的一种或数种。13.权利要求1
‑
12中任意一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：在给与受试者至少1
周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、2年、5年、10年、20年、40年之后，在受试者外周血能够检测到所述重组免疫细胞。14.权利要求13所述的重组免疫细胞，其特征在于：在给与受试者至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月之后，相对于同类免疫细胞总量，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例不低于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％；或者相对于外周血细胞总数，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例为1％
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35％、3
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30％或3
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20％。15.一种制备权利要求1
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14任一所述重组免疫细胞的方法，包括采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。16.根据权利要求15所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：基因敲除技术包括CRISPR/Cas技术、人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术、转录激活样效应因子(transcription activator
‑
like effector，TALE)技术或TALE
‑
CRISPR/Cas技术。17.根据权利要求16所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：CRISPR/Cas技术选自CRISPR
‑
Cas3、CRISPR
‑
Cas9、CRISPR
‑
Cas12、CRISPR
‑
Cas13、CRISPR
‑
CasX、CRISPR
‑
IscB系统。18.根据权利要求16所述的重组免疫细胞的方法，CRISPR/Cas技术选自CRISPR
‑
Cas9、CRISPR
‑
Cas12a、CRISPR
‑
Cas12b、CRISPR
‑
Cas13a、CRISPR
‑
Cas13b、CRISPR
‑
Cas13c、CRISPR
‑
Cas13e或CRISPR
‑
Cas13f系统。19.根据权利要求16
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18中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：在CRISPR/Cas技术中使用靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶，和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶。20.根据权利要求16
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19中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：在CRISPR/Cas技术的指导RNA(gRNA)中同时或分别包括靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)。21.根据权利要求16
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20中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法,在CRISPR/Cas技术中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者BCOR基因(NCBI Gene ID:54880或NCBI Gene ID:71458)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列；靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者ZC3H12A基因(NCBI Gene ID:80149或NCBI Gene ID:230738)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列。22.根据权利要求16
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21中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其中靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域包含序列ACTGGGCAATACCGCAACAG(SEQ ID NO:3)或者与SEQ ID NO:3具有至少85％、90％、95％同一性的序列；其中靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)的靶向结构域包含序列CTAGGGGAATTGGTGAAGCA(SEQ ID NO:4)或者与SEQ ID NO:4具有至少85％、90％、95％同一性的序列。23.根据权利要求15
‑
22中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：向免疫细胞中进一步导入带有作用靶点的CAR结构、TCR结构、配受体结构、STAR结构或其他细
胞过继治疗相应结构的序列。24.根据权利要求15
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23中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：向免疫细胞中进一步导入表达用于治疗疾病的生物分子；优选的，所述治疗疾病的生物分子选自IL
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23R蛋白、IL
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4R抗体、IFN
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α、IFN
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β、IFN
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γ、IL
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2、IL
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3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL
‑
6、IL
‑
8、IL
‑
12、IL
‑
13、IL
‑
22、IL
‑
23、IL
‑
24、TNF、TNF
‑
α、GM
‑
CSF、CD40L、CTLA
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4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1中的一种或数种。25.根据权利要求15
‑
24中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其中使用的载体是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体，所述病毒载体优选痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体；非病毒载体优选转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。26.根据权利要求16
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25中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：其sgRNA表达载体包括：载体
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启动子1
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sgZc3h12a
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启动子2
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标签
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P2A
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治疗疾病的生物分子序列、载体
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启动子1
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sgBcor
‑
启动子2
‑
标签
‑
P2A
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