一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用，属于兽用生物制品领域技术领域，本发明专利技术的目的是为了提供了一种构建非洲猪瘟减毒株的策略。本发明专利技术提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，所述重组减毒株是采用基因工程手段在非洲猪瘟病毒株Pig/CN/HLJ/2018中联合缺失了H240R基因和MGF505

【技术实现步骤摘要】
一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于兽用生物制品领域
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和全身器官出血为特征的急性、烈性、高度接触性传染病，强毒株死亡率接近100％。各阶段的家猪、野猪和软蜱是非洲猪瘟自然宿主，可在家猪和野猪之间直接传播，也可通过蜱虫叮咬传播，还可以通过污染了病毒的泔水、饲料和肉制品等跨区域和跨国家传播。当前没有商品化的疫苗和特效药物，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过捕杀手段进行控制，但这种方式不仅导致重大经济损失，也无法满足我国规模化养猪的需要。因此，研制有效、安全的疫苗十分迫切。
[0003]目前针对非洲猪瘟疫苗的研制主要通过三种方式：一、直接针对原始非洲猪瘟病毒进行灭活得到灭活疫苗；二、筛选出病毒诱导免疫应答的抗原蛋白，进而制备亚单位疫苗；三、采用基因缺失手段敲除毒力基因后获得重组病毒疫苗。其中第一种方法是制备病毒疫苗最常用的方法，由于非洲猪瘟病毒感染具有抗体依赖的增强作用(ADE)、免疫抑制等特征，导致灭活疫苗免疫猪无法提供有效的免疫保护作用；第二种方法限制因素是非洲猪瘟病毒基因组庞大、结果复杂，大部分功能未知，目前诱导的免疫应答的抗原还不清楚，已知的抗原还不能诱导有效的免疫保护作用。而目前最有希望突破的疫苗是基因敲除弱毒疫苗，通过对免疫抑制等毒力相关基因进行敲除，获得既具有免疫原性，又对猪没有致病作用的疫苗候选毒株，免疫猪后提供完全的保护作用。例如，中国专利CN110093324A提供了一种非洲猪瘟病毒七基因缺失弱毒株，该毒株是基于非洲猪瘟病毒Pig/CN/HLJ/2018株的七基因缺失弱毒株，其缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因编码产物和六个多基因家族基因(多基因家族360基因12L、13L、14L和多基因家族505基因1R、2R、3R)编码产物，接种仔猪免疫28天后，以ASFV原始毒进行攻毒试验，获得100％免疫保护；又如中国专利CN114107228A公开了一种十二基因缺失的减毒非洲猪瘟疫苗，在ASFV CN/GS 2018毒株中联合缺失了G
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ACD
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001900、MGF110
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9L、G
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ACD
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0021和九个多基因家族基因(多基因家族360基因9L、10L、11L、12L、13L、14L和多基因家族505基因1R、2R、3R)，接种仔猪后，以亲本毒株进行攻毒试验，获得100％免疫保护。
[0004]研究非洲猪瘟病毒毒力基因敲除疫苗需要考虑到对猪的免疫应答和保护，还要兼顾安全性能。在现有的技术中还需要考虑如下因素：(1)毒力基因敲除后是否带毒或排毒，这是基因缺失疫苗安全性的一个重要的指标；(2)非洲猪瘟病毒编码超过160个蛋白，毒力基因也众多，哪些毒力基因的缺失具有最佳的免疫保护性和安全性，这是一个长期艰巨的工作；(3)不同毒株缺失同一基因产生的效果不同，而且多基因缺失造成的病毒滴度低，也会使致弱毒株降低免疫原性或保护作用等风险。
[0005]因此，在非洲猪瘟减毒疫苗的制备过程中，鉴定基因功能及其对致病性和免疫应答的影响，为敲除靶标基因的选择和基因敲除的构建提供依据，新的靶标基因的筛选至关重要，决定着疫苗候选株的安全性和免疫的有效性。在MGF505
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7R基因的研究中，非洲猪瘟病毒Pig/CN/HLJ/2018株敲除MGF505
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7R基因，免疫剂量为105HAD
50
感染猪后致死率显著降低，但仍然存在部分毒力,猪存活率约为60％(Li et al.pMGF505
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7R determines pathogenicity of African swine fever virus infection by inhibiting IL
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1βand type I IFN production.PLOS PATHOGENS.2021)；非洲猪瘟病毒CN/GS/2018株敲除MGF505
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7R基因，较低的免疫剂量(10HAD
50
)感染猪后全部存活，但仍然存在明显的临床症状，如体温升高、带毒等(Li etal.African swine fever virus protein MGF
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505
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7R promotes virulence and pathogenesis by inhibiting JAK1
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and JAK2
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mediated signaling.Journal of Biological Chemistry.2021)。
[0006]非洲猪瘟病毒Pig/CN/HLJ/2018株敲除H240R基因(ASFV
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ΔH240R)，H240R基因编码蛋白的功能丧失，感染猪肺泡巨噬细胞诱导更高水平的干扰素反应及抗病毒基因高表达。通过动物实验将105HAD
50 ASFV
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ΔH240R感染猪，感染后第6天体温升高，且免疫后猪血液中存在带毒现象。现在亟需一款完全减毒并且免疫原性好的疫苗病毒株。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是为了提供了一种构建非洲猪瘟减毒株的策略以及提供一种完全减毒并且免疫原性好的疫苗病毒株。
[0008]本专利技术提供一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，所述重组减毒株是以非洲猪瘟病毒株为出发菌株，突变非洲猪瘟病毒的H240R和非洲猪瘟病毒的MGF505
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7R基因获得的。
[0009]进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒株为基因II型非洲猪瘟病毒。
[0010]进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒猪为Pig/HLJ/2018株。
[0011]进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒的H240R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述非洲猪瘟病毒的MGF505
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7R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]进一步地限定，所述非洲猪瘟病毒的H240R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述非洲猪瘟病毒的MGF505
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7R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术提供一种构建上述的重组减毒株的方法，其特征在于，所述的方法是通过基因工程手段突变非洲猪瘟病毒中的H240R基因和MGF505
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7R基因。
[0014]进一步地限定，所述的方法具体步骤如下：
[0015]步骤1，构建缺失H240R基因的重组病毒：将H240R基因如SEQ ID NO.2所示，与p72
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EGFP质粒连接获得p72
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...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒基因缺失的重组减毒株，其特征在于，所述重组减毒株是以非洲猪瘟病毒株为出发菌株，通过联合丧失非洲猪瘟病毒中H240R基因和MGF505
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7R基因编码蛋白的功能制备非洲猪瘟病毒重组减毒株。2.根据权利要求1所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒株为基因II型非洲猪瘟病毒。3.根据权利要求2所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒株为Pig/HLJ/2018株。4.根据权利要求1所述的重组减毒株，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒的H240R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述非洲猪瘟病毒的MGF505
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7R基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述非洲猪瘟病毒的H240R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述非洲猪瘟病毒的MGF505
‑
7R基因的核苷酸序列如SEQ ID ...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，翁长江，李江南，黄丽，赵东明，陈伟业，郑君，张朝霞，何希君，张险峰，关云涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：