sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法技术

本发明专利技术涉及基因编辑领域，具体涉及一种sgRNA序列及利用CRISPR‑Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法。本发明专利技术提供了一种可分离的核酸序列，包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列为SEQ ID NO:1所示核酸序列。所提供的sgRNA序列能够靶向到该可分离的核酸序列。利用本发明专利技术提供的核酸序列，构建表达载体，可以实现RH阳性血向RH阴性血的转变，从而满足输血的需求。

Sequence of sgRNA and preparation of RH-negative red blood cells by CRISPR-Cas9 technique

【技术实现步骤摘要】
sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法
本专利技术涉及基因编辑领域，涉及sgRNA序列及利用CRISPR-Cas9技术制备RH阴性红细胞的方法，具体涉及一种可分离的核酸序列、sgRNA序列、表达载体、重组细胞，RH阴性干细胞的制备方法以及RH阴性红细胞的制备方法。
技术介绍
输血治疗意义重大，血液输注除了补给血量、维持血容量，提高血压以抗休克和防止出血性休克外，还可供给具有携氧能力的红细胞以纠正因红细胞减少或其携氧能力降低所导致的急性缺氧症。输血过程对血型匹配的要求很高。血型由红细胞膜上特异性抗原类型决定，对输血安全发挥关键作用。除常见的ABO血型外，RH血型于1940年被发现，由于与恒河猴(Rhesusmonkey)红细胞的抗原物质相同，因而被命名为RH血型。通常把红细胞上含有D抗原的称为RH阳性，而不含有D抗原的称为RH阴性。RH阴性的个体在亚洲汉族人当中很稀有，比率为0.3％左右，在欧美等白种人中比例较高，为15％左右。RH血型不合的输血,有可能产生危及生命的溶血性输血反应，母子RH血型不合的妊娠则有可能发生新生儿溶血病，严重者可导致新生儿死亡，或是使胎儿死于子宫内。此外，正常RH阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当RH阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时RH阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入RHD阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡。目前RH血型的检查已被列为血型的常规检查之一。而由于RH阴性人群的稀少，为满足这部分人的输血需求，各血站也常年在数以万计的供血人群中筛选RHD(-)的供者。如何获得RH阴性的红细胞，对于输血治疗至关重要。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种编码sgRNA的核酸序列、sgRNA序列、表达载体、重组细胞，RH阴性干细胞的制备方法以及RH阴性红细胞的制备方法。本专利技术的专利技术人在研究过程中发现：干细胞多向分化的特性为血液供应提供了新的来源，由多能干细胞或造血干/祖细胞起始，经定向诱导分化与扩增，可以获得临床所需的功能性红细胞。我们的前期研究已实现干细胞向红细胞的有效诱导。而血型由基因决定，早在受精卵形成时血型即已确定，在干细胞向红系细胞分化时开始在细胞膜上表达血型糖蛋白，从而实质性表现出血型。通过在干细胞阶段对基因进行修改，可实现其所有子代细胞的血型改变。以此为基础，我们选择RHD基因上的特定位点，通过CRISPR/CAS9技术对基因组进行定点修改，提前终止RHD基因的表达，从而实现RH血型阳性向阴性的转变。利用该技术对胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、造血干/祖细胞(HSPC)的基因组做定点修饰，调整基因型为RHD阴性，继续诱导这些干细胞向红细胞分化，获得RH阴性红细胞，可满足临床输血的需要。由于红细胞没有细胞核，不保留遗传物质，因此可以忽略基因修饰对输注的影响。本专利技术确定有效的RHD基因靶位点，进而建立sgRNA(小向导RNA)序列和CRISPR载体，通过CRISPR/Cas9技术实现高效、特异的RHD基因敲除，从而建立RH阴性转基因干细胞和RH阴性人工诱导红细胞。本专利技术针对软件推测的多个RHD基因修饰位点构建CRISPR/Cas9载体，转染红白血病细胞系K562，进一步诱导K562细胞红系分化，通过比较RHD基因的敲除效率，以及脱靶敲除RHD的高保守性基因RHCE基因的可能性，最终筛选确定最佳的RHD基因敲除DNA序列和载体，构建RHD基因敲除干细胞系，获得RH阴性人工红细胞。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种可分离的核酸序列，所述核酸序列包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列选自下列中的至少一种：SEQIDNO:1所示核酸序列；SEQIDNO:2所示核酸序列；SEQIDNO:6所示核酸序列。这些sgRNA靶向序列能够特异性靶向到RHD基因上，抑制RHD基因的表达。利用这些序列构建表达载体，对干细胞进行基因改造，终止RHD基因的表达，可以实现RH血型阳性向阴性的转变，降低输血反应的发生，满足临床输血的需要。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种sgRNA序列，所述sgRNA序列能够靶向到本专利技术第一方面所述的可分离的核酸序列上。在本专利技术的一些实施例中，所述sgRNA序列选自下列中的至少一种：SEQIDNO:19所示的核酸序列；SEQIDNO:20所示的核酸序列；SEQIDNO:24所示的核酸序列。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供了一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第一方面所述的可分离的核酸序列。根据本专利技术的实施例，以上所述表达载体可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述表达载体能够编码sgRNA序列，所述sgRNA序列为本专利技术第二方面所述的sgRNA序列。在本专利技术的一些实施例中，所述表达载体进一步含有CRISPR-CAS9载体。利用CRISPR-Cas9载体和sgRNA序列构建获得CRISPR-CAS9sgRNA载体，利用sgRNA引导核酸酶(Cas9)到达DNA靶点，然后利用CRISPR技术实现基因的准确敲除，从而可以利用CRISPR-CAS9sgRNA载体获得RH阴性干细胞。借鉴成熟的干细胞向红细胞的诱导分化和脱核培养的技术，将获得的RH阴性干细胞进行诱导分化培养以及脱核培养，获得RH阴性红细胞，应用于输血领域，可以有效减少输血反应的发生。所用到的CRISPR-Cas9载体可以自己制备获得，也可以直接商购获得。根据本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本专利技术第三方面所述的表达载体。在本专利技术的一些实施例中，所述重组细胞为RH阴性干细胞。在本专利技术的一些实施例中，所述重组细胞为K562细胞。K562细胞为人类慢性髓系白血病细胞。该细胞具有多向分化潜能，能够分化成红系、粒系和单核系的可辨识的祖细胞。K562细胞可以作为受体细胞，能够被诱导并表达出RHD抗原，且K562细胞已经成系，相较于干细胞，培养起来更加方便，尤其适合于在前期进行多套表达载体的筛选。重组K562细胞中含有本专利技术第三方面所述的表达载体，能够特异性分化成为RH阴性红细胞。根据本专利技术的第五方面，本专利技术提供了一种RH阴性干细胞的制备方法，包括：将表达载体导入到干细胞中，筛选单细胞克隆，扩大培养获得RH阴性干细胞，所述表达载体为本专利技术第三方面所述的表达载体。通过将表达载体导入到干细胞中，可以预先在表达载体中加入筛选标记，或者利用表达载体本身所含有的筛选标记，将表达载体导入到干细胞中后，先利用筛选标记进行筛选，获得RHD表达阴性的干细胞，然后挑选单细胞克隆进行扩大培养，获得RH阴性干细胞，可以用作RH阴性红细胞的制备，从而获得RHD表达阴性的RH阴性血，用作输血，降低输血反应。在本专利技术的一些实施例中，所述干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞或者造血干/祖细胞中的至少一种。这些细胞均可以用来制备RH阴性干细胞。从发育阶段来说，胚胎干细胞更为原始，可由胚胎干细胞发育成造血干/祖细胞，再从造血干/祖细胞进一步发育分化为红细胞。由于胚胎干细胞更容易建立起本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可分离的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列为SEQ ID NO:1所示核酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种可分离的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括sgRNA靶向序列和/或其互补序列；所述sgRNA靶向序列为SEQIDNO:1所示核酸序列。2.一种sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列能够靶向到权利要求1所述的可分离的核酸序列上；任选地，所述sgRNA序列为SEQIDNO:19所示的核酸序列。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的可分离的核酸序列。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够编码sgRNA序列，所述sgRNA序列为权利要求2所述的sgRNA序列；任选地，所述表达载体进一步含有CRISPR-CAS9载体。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3或4所述的表达载体。6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为RH阴性干细胞；任选地，所述重组细胞为K562细胞。7.一种RH阴性干细胞的制备方法，其特征在于，包括：将表达载体导入到干细胞中，筛选单细胞克隆，扩大培养获得RH阴性干细胞，所述表达载体为权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：裴雪涛，谢小燕，曲洺逸，房芳，徐蕾，曾泉，岳文，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，华南生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11