重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用技术

本发明专利技术涉及重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖‑6‑磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4‑磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。本发明专利技术首次公开了在酵母中表达果糖‑6‑磷酸盐磷酸酮酶的过程中，果糖‑6‑磷酸在合成1,6‑二磷酸果糖的同时，被催化为赤藓糖‑4‑磷酸和乙酰磷酸，木酮糖‑5‑磷酸被催化为甘油醛‑3‑磷酸和乙酰磷酸，这改变了酵母中的碳代谢流量分布，增强酪醇生物合成重要中间物质的赤藓糖‑4‑磷酸的合成，优化了合成酪醇的代谢途径，提高酪醇及羟基酪醇等衍生物的产率。

【技术实现步骤摘要】
重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用
本专利技术涉及重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用，特别涉及一株通过外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphatephosphoketolase，fxp)的表达基因导入酵母，以及利用该菌株高效生产酪醇及其衍生物的方法，属于微生物基因工程

技术介绍
酪醇是天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，是苯乙醇的一种衍生物。别名红景天苷元，是红景天的主要药用活性成分，是红景天苷、羟基酪醇的前体物质。可以保护细胞免受氧化伤害，是一种具有重要工业价值的酚类化合物，酪醇及其衍生物是多种有机化合物的合成前体，酪醇可被用于医药剂。酪醇的衍生物羟基酪醇是一种具有很强的抗氧化作用及多种生理医药功能，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，同时可以合成很多聚合物，且没有已知毒性，在生物医药、功能食品等行业应用广泛，具有预防心血管、骨质缺乏等疾病的发生。目前，羟基酪醇的获得主要是从橄榄叶中提取，从植物中提取，成本高，占用大量的耕地。化学法中利用苯乙醇合成法，大多先采用保护羟基，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。苯乙醇价格高供应紧张，利用硝基甲苯合成，价格低廉但步骤较长，产率低，利用对羟基苯乙烯合成产率达到96％，纯度99％，产率和纯度都很高，具有一定的价值，但原料成本较高。化学法制备酪醇原料成本高且环境不友好，这些都直接制约了酪醇的工业化生产。因此，生物法合成酪醇及其衍生物已经成为研究热点。酪醇(Tyrosol)具有以下特征：化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)phenol，分子式为C8H10O2，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式为中国专利文献CN108753636A(申请号201810601213.8)公开了一种生产酪醇及羟基酪醇的酵母及构建方法，将PcAAS和ADH序列导入酵母BY4741，得到生产酪醇的PcAAS-ADH重组酵母；在所述PcAAS-ADH重组酵母中导入pdc1基因敲除盒、tyrA表达盒得到生产酪醇的PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母；将HpaBC的DNA序列导入PcAAS-ADH-Δpdc1-tyrA重组酵母，得到生产羟基酪醇的PcAAS-ADH-HpaBC-Δpdc1-tyrA重组酵母。在酵母BY4741中构建酪醇或羟基酪醇生物合成途径，提高酪醇或羟基酪醇的产量。该技术虽然可以提高酵母中酪醇的产量，但酪醇产量仍然无法达到工业化生产的要求。受限于酵母中酪醇的合成受多种代谢途径的影响，且相关代谢途径并未完全研究清楚，因此，如何实现酪醇酵母发酵工业化仍然是目前亟需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供重组酵母、构建方法和其在制备酪醇及衍生物中的应用。本专利技术的目的之一是在专利技术专利申请(申请号201810601213.8)的基础上，在酵母中表达来源于青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)菌种编号为ATCC15703的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphatephosphoketolase,EC4.1.2.22)(氨基酸序列如GenBank:BAF39468.1所示，SEQIDNO.1)或短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)BBRI4的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(Fructose-6-phosphatephosphoketolase,EC4.1.2.22)(氨基酸序列如GenBank:KND53308.1所示，SEQIDNO.2)的基因片段等，通过构建由果糖-6-磷酸催化生成酪醇生物合成重要前体物质赤藓糖-4-磷酸的新途径，提高酪醇的产率。本专利技术的目的之二是提供一种生产羟基酪醇的方法。本专利技术的目的之三是提供一种生产酪醇的酵母的构建方法。本专利技术的目的之四是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产酪醇中的应用。本专利技术的目的之五是提供所述一种生产酪醇的酵母或构建方法在生产羟基酪醇中的应用。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案如下：重组酵母在生产酪醇中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。根据本专利技术优选的，所述经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得。根据本专利技术进一步优选的，所述芳香醛合成酶来源于香芹，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12；所述预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌(E.coli)，酶的系统编号EC1.3.1.12，EC5.4.99.5。根据本专利技术优选的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacteriummongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)等。更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。根据本专利技术优选的，所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotor本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组酵母在生产酪醇中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖‑6‑磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4‑磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。

【技术特征摘要】
1.重组酵母在生产酪醇中的应用，所述重组酵母为将外源性的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因导入经过改造的酵母细胞中构建获得，所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经过改造的酵母细胞为将芳香醛合成酶和分支酸变位酶/预苯酸脱水酶整合后获得；进一步优选的，所述芳香醛合成酶来源于香芹，酶的系统编号EC4.1.1.25；所述分支酸变位酶来源于大肠杆菌，酶的系统编号EC1.3.1.12和EC5.4.99.5；所述预苯酸脱水酶来源于大肠杆菌，酶的系统编号5.4.99.5。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)、齿双歧杆菌(Bifidobacteriumdentium)、肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、摩恩格里艾恩斯双歧(Bifidobacteriummongoliense)、类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)、胚牙乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、新生隐球菌(Cryptococcusneoformans)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、加德纳菌(Gardnerellavaginalis)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)等；更优的，所述果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示，表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述酵母细胞为：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)、腐生性酵母菌红酵母菌(Rhodotorulaglutinis)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、巴氏酵母(Saccharomycespastorianus)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、鲁氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、光滑念珠菌(Candidaglabrata)、德布尔有孢酵母(Torulasporadelbrueckii)、汉斯德巴氏酵母菌(Debaryomyceshansenii)、树干毕赤酵母(Scheffersomycesstipites)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozymaguilliermondii)、长孢洛德酵母(Lodderomyceselongisporus)、白假丝酵母菌(Candidaalbicans)、拟平滑念珠菌(Candidaorthopsilosis)、似平滑念珠菌(Candidametapsilosis)、都柏林酵母菌(Candidadubliniensis)、葡萄牙棒孢酵母(Clavisporalusitaniae)、耳念珠菌(Candidaauris)等；进一步优选的，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，菌种编号为CICC1964；更优选的，所述经过改造的酵母细胞为将来源于香芹(Petroselinumcrispum)的芳香醛合成酶整合到酿酒酵母CICC1964的delta12位点，并将来源于大肠杆菌(E.coli)的分支酸变位酶/预苯酸脱水酶替换酿酒酵母CICC1964的pdc1基因，获得。5.一种高产酪醇的重组酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建表达盒，表达盒由启动子、终止子、同源臂以及果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因经融合后获得；(2)将步骤(1)构建的表达盒转化至经过改造的酵母细胞，制得高产酪醇的重组酵母；所述经过改造的酵母细胞为具有经4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸合成酪醇代谢途径的酵母细胞。6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶的表达基因来源于青春双岐杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、两歧双歧杆菌短双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、短双歧杆菌(Bif...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，郭伟，侯少莉，
申请(专利权)人：烟台华康荣赞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37