生产目标物质的方法技术

提供了用于生产目标物质诸如香草醛和香草酸的方法。通过使用具有目标物质生产能力的微生物从碳源或目标物质的前体生产目标物质，所述微生物已经经修饰而具有拟杆菌门O‑甲基转移酶(OMT)，尤其是编码具有特定突变的OMT的OMT基因。

Method of Producing Target Substances

Methods for the production of target substances such as vanillin and vanillic acid are provided. The microorganism has been modified to possess Bacterioides O -methyltransferase (OMT), especially the OMT gene encoding a specific mutation, by producing the target substance from the precursor of the carbon source or the target substance by using microorganisms with the production capacity of the target substance.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生产目标物质的方法专利
本专利技术涉及通过使用微生物生产目标物质，诸如香草醛和香草酸的方法。专利技术背景香草醛是提供香草气味的主要成分，并且用作食品、饮料、香水等中的芳香物。香草醛通常通过从天然产物中提取或通过化学合成来生产。已经尝试在生产香草醛的方法中尝试生物工程技术，例如通过使用各种微生物与丁香油酚、异丁香油酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子壳等(KaurB.andChakrabortyD.,Biotechnologicalandmolecularapproachesforvanillinproduction:areview.ApplBiochemBiotechnol.2013Feb；169(4):1353-72)。另外，使用生物工程技术生产香草醛的其他方法包括以糖苷生产(WO2013/022881和WO2004/111254)，使用香草醛合酶从阿魏酸生产香草醛(JP2015-535181)，通过大肠杆菌发酵来生产香草酸，然后将香草酸酶促转化为香草醛(美国专利No.6,372,461)。香草醛可以经由中间体原儿茶酸产生。具体地，原儿茶酸可以转化成香草酸或原儿茶醛，并且香草酸或原儿茶醛然后可以转化成香草醛。O-甲基转移酶(OMT)催化使原儿茶酸和/或原儿茶醛甲基化以产生香草酸和/或香草醛的反应，即间位的羟基基团的甲基化。OMT也可以催化使原儿茶酸和/或原儿茶醛甲基化以产生异香草酸和/或异香草醛的反应，即对位的羟基基团的甲基化，作为副反应。选择性催化间位的羟基基团的甲基化的突变体OMT可以用于产生目标物质，诸如香草醛(参见WO2013/022881)。专利技术概述本专利技术描述了用于改善目标物质诸如香草醛和香草酸的生产的新技术，因此提供了用于有效生产目标物质的方法。本专利技术的一方面是通过突变O-甲基转移酶(OMT)以使它在选择的微生物中具有特定突变，微生物可以以显著改善的方式生产目标物质诸如香草酸。本专利技术的一方面提供了生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使该微生物具有属于拟杆菌门(Bacteroidetes)的细菌天然的O-甲基转移酶基因的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：香草醛、香草酸、阿魏酸、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述生产包括通过使用所述微生物以将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述转化包括在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述转化包括在反应混合物中允许所述微生物的细胞作用于所述前体以在所述反应混合物中生产和积累所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养液中的细胞、从所述培养液中收集的细胞、存在于所述培养液的加工产物中的细胞、存在于收集的细胞的加工产物中的细胞，或这些的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述前体选自由以下组成的组：原儿茶酸、原儿茶醛、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，所述方法还包括收集所述目标物质。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述属于拟杆菌门的细菌是属于Niastella、Terrimonas或Chitinophaga属的细菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述O-甲基转移酶基因是编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:141的氨基酸序列的蛋白质，(b)包含SEQIDNO:141的氨基酸序列，且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，且其中所述蛋白质具有O-甲基转移酶活性，(c)包含与SEQIDNO:141的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有O-甲基转移酶活性，和(d)包含(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质但具有特定突变的氨基酸序列的蛋白质，其中所述特定突变是选自由以下组成的组的氨基酸残基处的突变：D21、L31、M36、S42、L67、Y90、P144和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述特定突变选自由以下组成的组：D21Y、L31H、M36(K、V)、S42C、L67F、Y90(A、C、G、S)、P144(E、G、S、V、Y)和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述特定突变选自由以下组成的组：D21Y/M36K/L67F,D21Y/M36K/L67F/Y90A,L31H/M36K/L67F/P144V,L31H/L67F/Y90A,M36K/S42C/L67F,M36K/L67F,M36K/L67F/Y90A,M36K/L67F/Y90A/P144E,M36K/L67F/Y90C,M36K/L67F/Y90C/P144V,M36K/L67F/Y90G,M36K/L67F/Y90S/P144G,M36K/L67F/P144S,M36K/L67F/P144Y,M36K/Y90A/P144V,M36K/P144E和M36V/L67F/P144S。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌细菌或酵母。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于棒状杆菌属的细菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是属于埃希氏菌属的细菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与所述目标物质的生物合成的酶的活性得以增加的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述参与目标物质的生物合成的酶选自由以下组成的组：3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、芳族醛氧化还原酶和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性得以增加的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比参与除所述目标物质以外的物质的副生产的酶的活性得以降低的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述参与除目标物质以外的物质的副生产的酶选自由以下组成的组：香草酸脱甲基酶、原儿茶酸3,4-双加氧酶、醇脱氢酶、莽草酸脱氢酶和它们的组合。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所述微生物已经以与未修饰的菌株相比L-半胱氨酸生物合成酶的活性得以增加的方式进行了进一步的修饰。本专利技术的另一方面提供了如上文描述的方法，其中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使该微生物具有源自属于拟杆菌门的细菌的O‑甲基转移酶基因的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：香草醛、香草酸、阿魏酸、愈创木酚、4‑乙烯基愈创木酚、4‑乙基愈创木酚和它们的组合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.26 US 62/413,061;2016.11.04 US 62/417,6171.一种生产目标物质的方法，所述方法包括以下步骤：通过使用具有生产所述目标物质的能力的微生物来生产所述目标物质，其中所述微生物已经以使该微生物具有源自属于拟杆菌门的细菌的O-甲基转移酶基因的方式进行了修饰，且其中所述目标物质选自由以下组成的组：香草醛、香草酸、阿魏酸、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚和它们的组合。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：在含有碳源的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生产包括：通过使用所述微生物以将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化包括：在含有所述前体的培养基中培养所述微生物以在所述培养基中生产和积累所述目标物质。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化包括：在反应混合物中允许所述微生物的细胞作用于所述前体以在所述反应混合物中生产和积累所述目标物质。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞是存在于所述微生物的培养液中的细胞、从所述培养液中收集的细胞、存在于所述培养液的加工产物中的细胞、存在于收集的细胞的加工产物中的细胞，或这些的组合。7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述前体选自由以下组成的组：原儿茶酸、原儿茶醛、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和它们的组合。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，所述方法还包括收集所述目标物质。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述属于拟杆菌门的细菌是属于Niastella、Terrimonas或Chitinophaga属的细菌。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述O-甲基转移酶基因是编码选自由以下组成的组的蛋白质的基因：(a)包含SEQIDNO:141的氨基酸序列的蛋白质，(b)包含SEQIDNO:141的氨基酸序列，且该氨基酸序列包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加的蛋白质，且其中所述蛋白质具有O-甲基转移酶活性，(c)包含与SEQIDNO:141的氨基酸序列具有90％或更高的同一性的氨基酸序列的蛋白质，且其中所述蛋白质具有O-甲基转移酶活性，和(d)包含(a)、(b)或(c)中定义的蛋白质但具有特定突变的氨基酸序列的蛋白质，其中所述特定突变是选自由以下组成的组的氨基酸残基处的突变：D21、L31、M36、S42、L67、Y90、P144和它们的组合。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述特定突变选自由以下组成的组：D21Y、L31H、M36(K、V)、S42C、L67F、Y90(A、C、G、S)、P144(E、G、S、V、Y)和它们的组合。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述特定突变选自由以下组成的组：D21Y/M36K/L67F、D21Y/M36K/L67F/Y90A、L31H/M36K/L67F/P144V、L31H/L67F/Y90A、M36K/S42C/L67F、M36K/L67F、M36K/L67F/Y90A、M36K/L67F/Y90A/P144E、M36K/L67F/Y90C、M36K/L67F/Y90C/P144V、M36K/L67F/Y90G、M36K/L67F/Y90S/P144G、M36K/L67F/P144S、M36K/L67F...

【专利技术属性】
技术研发人员：B米吉茨，S莫迪，M西迪奎，C罗切，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP