本发明专利技术涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。一种制备（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇的方法，α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇。该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备（R）‑2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇，实现底物99%以上的转化率，所制备的产物ee值不低于98.5%，且反应的底物浓度接近280g/L,具备工业放大生产的价值。该反应能够使得底物完全、高效的转化成为目标产物，并且所制备的产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。
【技术实现步骤摘要】
一种制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法
本专利技术涉及一种中间体制备方法，尤其涉及一种制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法。
技术介绍
去氧肾上腺素是一种α1受体激动药物，具有血管收缩作用，在临床中应用广泛，并呈稳定的增长趋势。1927年德国化学家HelmutLegerlotz首次合成了去氧肾上腺素，之后又分离得到其手性异构体。去氧肾上腺素（phenylephrine，PE）侧链α碳为手性碳原子，其R(-)-异构体的α1-肾上腺素受体激动作用远强于S(+)-异构体，因此R型去氧肾上腺素在临床上广泛应用于阵发性室上性心动过速，治疗休克及麻醉时维持血压，在眼科检查中可作为安全的短效扩瞳药使用。作为伪麻黄碱最简单有效的替代品，R型去氧肾上腺素在非处方感冒药中的使用也呈现增长趋势。最初R型去氧肾上腺素广泛利用L-(+)-酒石酸作为拆分剂，经过手性拆分得到S型去氧肾上腺素-L-(+)-酒石酸盐结晶，氨水碱化后，经水洗、干燥得S型去氧肾上腺素。而R型去氧肾上腺素-L-(+)-酒石酸盐留在母液中，加氨水回收得R型去氧肾上腺素。得到的S型去氧肾上腺素在酸性或碱性条件下外消旋化，可再次进行拆分，从而提高整体产率。具体文献见：BaoWN，PanHF，ZhangZH，etal.IsolationofthestablestrainLabryssp.BK-8forL-(+)-tartaricacidproduction[J].JournalofBioscienceandBioengineering，2014，118（1）：1-5.除此之外，还包括与萘普生拆分工艺串联的方法及水解动力学拆分方法等。随着去氧肾上腺素合成工艺的改进，越来越多的生产厂家采用不对称合成方法制备R型去氧肾上腺素。目前常见的不对称合成法制备R型去氧肾上腺素中，研究最早、应用最普遍的是不对称氢化法。除此之外，Sharpless不对称双羟基化法、Salen催化醛的Henry反应法也是合成R型去氧肾上腺素的有效途径。文献2008年Hossein（WO2009086283）最先报道了钌手性双膦催化剂不对称催化氢化合成S型去氧肾上腺素的方法。他们以α-甲氨基-间羟基乙酰苯为原料，形成硫酸盐后，在3MPa下利用钌-手性双膦催化剂进行不对称催化氢化，之后再用氨水中和得R型去氧肾上腺素，产品光学纯度为95%ee。2010年McGarrity等（Tetrahedron：Asymmetry，2010（21）：2479-2486）则直接用钌双配体催化剂[(R)-Xyl-P-PhosRuCl2(R)-DAIPEN]催化α-甲氨基-间羟基乙酰苯的不对称氢化反应得到R型去氧肾上腺素；(R)-Xyl-P-Phos为C手性双膦配体，(R)-DAIPEN为手性二胺配体，反应时间为16h，产品光学纯度为96%ee。2011年冯文化等（CN102234237）利用商品化的(R)-BINAP-Ru(II)类催化剂催化合成了L-去氧肾上腺素。(R)-BINAP为C-手性双齿双膦配体，还原所得粗品光学纯度为75%ee，经甲醇结晶后可达96%ee。以上所列文献反应如式I所示：式I更有采用酶催化技术改进R型去氧肾上腺素的制备工艺，2013年巴斯夫欧洲公司的Breuer等（US8617854）公开了固氮弧菌属物种EBN1的醇脱氢酶催化合成R型去氧肾上腺素的方法，该酶可在大肠杆菌中重组制备。该路线是以间羟基苯乙酮为起始原料，丙醇存在的情况下与磺酰氯反应得到α-氯代-3-羟基苯乙酮，之后以固氮弧菌属物种EBN1的醇脱氢酶作为生物催化剂，以NADP作为电子供体，在葡萄糖脱氢酶和2-丁醇存在的条件下，将α-氯代-3-羟基苯乙酮还原成手性醇，甲胺胺化后得到L-去氧肾上腺素，产品光学纯度大于99%ee。反应路线如式II：式II式II所示的路线关键工艺在于通过酶催化制备出关键中间体（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，然后合成出R型去氧肾上腺素。该工艺虽然实现了酶法制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，但该文献所提供酶催化反应的浓度不得超过8.5g/L，并且采用连续加料、MTBE持续萃取出反应液中生成的（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的工艺，每1000mL反应液最终生成（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的量不超过175g。并且该工艺超过一半的溶液质量为有机溶剂，降低了酶催化绿色化学工艺的优点，增加反应成本和环境污染成本。这种低浓度长时间且不环保的酶催化工艺并不具备工业上大规模生产的应用价值。因此，目前急需一种新的高效制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇并实现工业化应用的技术，提高药物R型去氧肾上腺素的生产效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法；本专利技术的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶及其氨基酸序列；本专利技术的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶的基因序列，此基因序列能够编码上述酮还原酶；本专利技术的另一个目的在于提供包含上述酮还原酶基因序列的载体及工程菌体；本专利技术的最终目的在于提供一种利用酮还原酶催化α-氯代-3-羟基苯乙酮制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，该方法能够高效、高纯度的制备出（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。技术方案一种制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，如式III，将α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇：式III式III中所采用的酮还原酶（KRED）的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶。进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备85%以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，优选为具备93%以上的同源性，更优选为具备95%以上的同源性，最优选为具备97%以上的同源性。进一步，所述酮还原酶的基因如下（c）或（d）：（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所示；（d）、与（c）具有N%以上的同源性（N选自85、90、95、99），且能编码催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转换为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶的基因。一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。进一步，所述酮还原酶催化α-氯代-3-羟基苯乙酮制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的工艺步骤包括：将α-氯代-3-羟基苯乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备（R）‑ 2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇的方法，其特征在于：α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑ 2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮转化为（R）‑ 2‑氯‑1‑（3‑羟基苯基）乙醇的酮还原酶。
【技术特征摘要】
1.一种制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，其特征在于：α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶。2.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，其特征在于：（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，且能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇。3.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如下（c）或（d）所示：（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所示基因序列；（d）、与（c）具有90%以上的同源性，且能催化α-氯代-3-羟基苯乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的酮还原酶的基因序列。4.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3-羟基苯基）乙醇的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，包蕾，胡集铖，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31
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