一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法技术

本发明专利技术涉及酶法制备手性醇，属于基因工程技术用于制备医药中间体的领域。一种制备（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的方法，2‑氯‑1‑( 3,4‑二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇。该方法通过筛选出特定氨基酸序列的酮还原酶用于催化制备（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇，实现底物99%以上的转化率，所制备的产物ee值为100%。并且后续产物分离提纯简单，后处理成本低，整个工艺流程环境友好度高，原子利用率高。

A Method for Preparing (R) -2-chloro-1-(3,4-difluorophenyl) Ethanol

The invention relates to the preparation of chiral alcohols by enzymatic method, and belongs to the field of genetic engineering technology for preparing pharmaceutical intermediates. A method for preparing (R) 2 chloro 1 (3,4 difluorophenyl) ethanol, in which 2 chloro (3,4 difluorophenyl) ethyl ketone is converted to (R) 2 chloro (1 (3,4 difluorophenyl) Ethanol Catalyzed by ketone reductase. In this method, keto reductase with specific amino acid sequence was screened and used to catalyze the preparation of (R) 2 chloro 1 (3,4 difluorophenyl) ethanol. The conversion of substrates was more than 99%, and the EE value of the prepared product was 100%. And the subsequent product separation and purification is simple, the post-treatment cost is low, the whole process is environmentally friendly, and the atomic utilization rate is high.

【技术实现步骤摘要】
一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法
本专利技术涉及一种中间体制备方法，尤其涉及一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法。
技术介绍
替格瑞洛是一种血小板聚集抑制剂，其临床疗效和安全性已得到血小板抑制和患者后果结局研究（PLATO研究）及其多项亚组研究的验证和支持。PLATO研究也显示替格瑞洛的疗效明显优于氯吡格雷，所以被国内外多个指南列于一线推荐。替格瑞洛的生产制备、质量分析及相关的生物体实验中，替格瑞洛分子的光学异构体起到重要的标样或对照实验的作用。目前并没有专用于替格瑞洛光学异构体的合成工艺，而是借助于原有的替格瑞洛合成路线，通过改变手性中间体的分子构型，制备出替格瑞洛光学异构体。替格瑞洛的合成路线如式I：式I式II式II所示的化合物作为制备替格瑞洛的关键中间体，向替格瑞洛分子中引入了手性中心。现有技术中式II所示的手性分子主要通过式III所示的（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子经多步反应得到（见专利文件WO2008018822、WO2008018823及SinghAK；RaoMN;SimpsonJH;etal，Org.ProcessRes.Dev.2002,6,618-620.及ZhangH;Liu;zhangL.Y;etal.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2012,22,3598-3602），因此式III所示（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇分子是替格瑞洛原料药分子手性中心的来源，只需要制备出（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）即可通过现有合成路线制备出替格瑞洛分子的光学异构体。式III式VII但现有技术中并没有一种高效制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）分子的方法，只能通过成本相对比较高的化学法合成消旋体，然后通过HPLC纯化分离得到。这使得（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）制备成本高，收率低，专业性不强。现有技术中式III的制备工艺如专利CN105969757A、专利CN105671099A、CN106047828以及文献ApplMicrobiolBiotechnolDOI10.1007/s00253-016-7947-0所记载，这四篇文献给出采用酮还原酶的方法，通过式V制备出（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）：式V但以上文献所记载的酮还原酶只对制备（S）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式III）具备较高的催化活性，并不适用于（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇（式VII）的制备。因此，目前急需一种新的高效制备式VII所示（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇并实现工业化应用的技术，提高该化合物的生产效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法；本专利技术的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶及其氨基酸序列；本专利技术的另一个目的在于提供上述制备方法所用到的酮还原酶的基因序列，此基因序列能够编码上述酮还原酶；本专利技术的另一个目的在于提供包含上述酮还原酶基因序列的载体及工程菌体；本专利技术的最终目的在于提供一种利用酮还原酶催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，该方法能够高效、高纯度的制备出（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。技术方案一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇：式IV式IV中，Acetone为丙酮、Isopropylalcohol为异丙醇，所述酮还原酶（KRED）的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶。进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备85%以上的同源性，且该氨基酸序列所编码的酮还原酶能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。进一步，（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，优选为具备93%以上的同源性，更优选为具备95%以上的同源性，最优选为具备99%以上的同源性。进一步，所述酮还原酶的基因如下（c）或（d）：（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所示；（d）、与（c）具有N%以上的同源性（N选自85、90、95、99），且能编码催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转换为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因。一种含有上述基因的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系。进一步，上述酮还原酶以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、含酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，用于催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。进一步，所述酮还原酶催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的工艺步骤包括：将2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮、酮还原酶酶粉或含有酮还原酶的细胞（本技术方案中所述“含有酮还原酶的细胞”是指本
常见的用于生产发酵的工程细菌，比如酵母菌、大肠杆菌等。）、缓冲剂配置成水/异丙醇混合溶液，反应得到产物。进一步，所述2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮浓度为1～240g/L，优选为100～200g/L，更优选为150～200g/L；进一步，所述酮还原酶的酶粉使用质量与含有酮还原酶细胞的使用质量之比为1:4～6。即1质量份数的酮还原酶酶粉催化效率相当于4～6质量份数酮还原酶细胞的催化效率。进一步，所述含有酮还原酶的细胞浓度为10～50g/L，优选为20～40g/L。如果采用酮还原酶酶粉替换酮还原酶细胞，则酮还原酶酶粉的使用浓度为2～10g/L；进一步，所述水/异丙醇溶液中，水与异丙醇体积比为1:0.3～0.5，优选为1:0.35～0.45；进一步，反应体系中可以加入辅因子促进反应，当采用含酮还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的酮还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅因子促进反应时，所述辅因子选自NAD+、NADH、NADP+和NADPH的任意一种或它们的组合物，优选为NADP+；所述辅因子浓度为0.02～0.2g/L，优选为0.08～0.12g/L。进一步，所述缓冲剂为磷酸-磷酸盐缓冲剂、柠檬酸-柠檬酸盐缓冲剂，优选为磷酸-磷酸盐缓冲剂；缓冲剂的pH为6.5～7.5，优选为6.8～7.2；缓冲剂摩尔浓度为0.01～0.5mol/L,优选为0.05～0.2。进一步，所述催化2-氯-1-(3,4-二氟苯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：2‑氯‑1‑( 3 ,4‑二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQ ID No.2 所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQ ID No.2 中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化2‑氯‑1‑( 3 ,4‑二氟苯基)乙酮转化为（R）‑2‑氯‑1‑（3,4‑二氟苯基）乙醇的酮还原酶。

【技术特征摘要】
1.一种制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇，所述酮还原酶的氨基酸序列如（a）或（b）所述：（a）、所述酮还原酶具有如表SEQIDNo.2所记载的氨基酸序列；（b）、所述酮还原酶为将表SEQIDNo.2中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶。2.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：（b）所述的酮还原酶的氨基酸序列与（a）所述酮还原酶的氨基酸序列具备90%以上的同源性，且能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇。3.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的方法，其特征在于：所述酮还原酶的基因序列如下（c）或（d）所示：（c）、基因的核苷酸序列为序列表SEQIDNo.1所示基因序列；（d）、与（c）具有90%以上的同源性，且能催化2-氯-1-(3,4-二氟苯基)乙酮转化为（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇的酮还原酶的基因序列。4.如权利要求1所述的制备（R）-2-氯-1-（3,4-二氟苯基）乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，包蕾，胡集铖，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31