具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用，属于生物来源杀菌剂和农药加工工艺领域，具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，包括制备发光杆菌发酵液、DHIS的分离与纯化、结构鉴定，并提供了发光杆菌发酵液中DHIS含量分析的方法，以及用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病的应用及使用方法。本发明专利技术优化了对发光杆菌的发酵条件，大大提高了3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯的产量，本发明专利技术制备的DHIS对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于DHIS在空气中不稳定而导致的防效降低。

【技术实现步骤摘要】
具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法和应用
本专利技术属于生物来源杀菌剂和农药加工工艺，具体是涉及一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用。
技术介绍
灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一种世界性病害。随着温室和大棚中番茄栽培面积的不断扩大，导致灰霉病成为主要病害之一，每年都会造成大量经济损失，一般为20％～40％，严重的达60％。目前，防治灰霉病以化学防治为主，常用的杀菌剂主要有二甲酰亚胺类杀菌剂、苯并咪唑类杀菌剂、苯胺基嘧啶类的嘧霉胺、啶酰菌胺和咯菌腈等。化学农药虽然取得了一定的防治效果，但其带来的“3R(residue,resistance,resurgence)”问题已经引起社会和国内外有关专家的高度重视，开发高效、低毒、对环境安全的生物农药，已成为农药研发的主要途径之一。3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(简称DHIS，见图1)，该化合物广泛存在于发光杆菌的发酵液中，它被称为“瑞士军刀”具有很突出的生物活性，例如可抑制热带疾病中的原生生物，可抗真菌和抗革兰氏阳性菌，杀线虫，可抑制溶性环氧化合物水解酶[solubleepoxidhydrolase(sEH)]和在不同的肿瘤细胞系中显示抗增殖活性，可治疗银屑病，可治疗免疫和炎症等疾病，如专利(申请号为：201710084890.2)报道了该化合物作为杀螨剂及其治疗性应用。目前该化合物的制备路线从酸开始，进行了米迦勒加成、克莱森缩合反应、一锅法、皂化和脱羧等一系列反应，该方法产量低、分离纯化困难。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术的目的是提出一种具有抗灰葡萄孢菌活性的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯(DHIS)的制备方法和应用，本专利技术优化了对发光杆菌的发酵条件，大大提高了3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量，本专利技术制备的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在空气中不稳定而导致的防效降低。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的，本专利技术提供了具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其技术要点是：(1)制备发光杆菌发酵液所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10日；保藏编号为：CCTCCNO：M2018664，分类命名为：Photorhabdustemperatasubsp.cinereaSN35。所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180r/min、28℃的恒温摇床上培养120h得到发光杆菌发酵液；所述改良M培养基的配方为：蛋白胨为15-35g/L，氯化钠为1-5g/L，葡萄糖6.13g/L，硫酸镁1.50g/L，硫酸铵2.46g/L，磷酸二氢钾0.86g/L，磷酸氢二钾1.11g/L，硫酸钠1.72g/L，亮氨酸3.00g/L，蒸馏水1L，pH值7.2～7.6；(2)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的分离与纯化将步骤(1)中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体，收集上清液，向上清液中加入5％的大孔树脂吸附4h后将大孔树脂取出放置在30℃烘箱中充分烘干，烘干后用甲醇浸泡3-4次，将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏，浸膏用甲醇：水＝1：1的溶液再次溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏；将二氯甲烷浸膏用正相硅胶柱(350mm×30mmi.d.)分离纯化，依次用V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝(100:5、100:10、100:20、100:30、100:40和0:100)梯度洗脱，每个梯度3L，得到5个组分(A1-A5)；然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析，SephadexLH-20凝胶柱层析制备得到；(3)3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的结构鉴定将步骤(2)中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的结构。进一步的，所述改良M培养基配方为：葡萄糖6.13g/L，蛋白胨33.23g/L，硫酸镁1.50g/L，硫酸铵2.46g/L，磷酸二氢钾0.86g/L，磷酸氢二钾1.11g/L，硫酸钠1.72g/L，亮氨酸3.00g/L，氯化钠3.01g/L，蒸馏水1L，pH值7.2～7.6。进一步的，所述发光杆菌发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量分析的方法，包括以下步骤：(1)通过向40mL的改良M培养基中接种等量的种子液培养得到发酵液，再离心、过滤对发酵液进行预处理；(2)在高效液相色谱分析过程中，色谱条件为：色谱柱：AgilentZORBAXEclipseXDB，4.60×250mm，5μm；流动相：68％甲醇水+0.1％甲酸溶液；进样体积：10μL；流速1.0mL/min，柱温：30-39℃；检测波长：247nm；(3)在步骤(2)的色谱条件下绘制发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量的标准曲线，具体的回归方程如下：Y＝10069X+3.7629(R2＝0.9974)，其中Y为峰面积，X为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的浓度，单位为g/L。本专利技术提出了一种具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的应用，其技术要点是：3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯可以用于防止由灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病。进一步的，所述灰葡萄孢菌引起的植物灰霉病包括黄瓜灰霉病和番茄灰霉病。进一步的，所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯防治植物灰霉病的方法为叶片喷雾，处理浓度为100-500μg/mL。进一步的，所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯可以与抗氧化剂混合应用，所述抗氧化剂包括丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)，所述3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯与抗氧化剂的重量比为1：0.5-1.5。本专利技术的积极效果：(1)本专利技术优化对发光杆菌的发酵条件，所述改良M培养基在M基础培养基中添加氯化钠和亮氨酸，有助于提高3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的产量，为以后工业化生产提供了理论依据。(2)本专利技术制备的3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯对黄瓜和番茄灰霉病具有优异的防治效果，这为开发抗灰霉病的药剂奠定了基础，此外，在配药剂时添加了抗氧化剂作为保护，有效防止了由于3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯在空气中不稳定而导致的防效降低。(3)本专利技术中建立了高效液相色谱法快速测定发光杆菌发酵液中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯含量的方法，该方法简单易行、结果准确可靠，线性范围广，能够满足常见发光杆菌属中3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的含量测定，可作为后续工业化生产的一杆秤。附图说明图1为3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的化学结构；图2为HPLC测定3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯标准曲线；图3为改良培养基中蛋白胨和氯化钠之间的响应面图和等高线图；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：包括以下步骤：（1）制备发光杆菌发酵液所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10日；保藏编号为：CCTCC NO：M2018664，分类命名为：Photorhabdus temperata subsp. cinerea SN35；所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180 r/min、28 °C的恒温摇床上培养120 h得到发光杆菌发酵液；所述改良M 培养基的配方为：蛋白胨为15‑35 g/L，氯化钠为1‑5 g/L，葡萄糖6.13 g/L，硫酸镁 1.50 g/L，硫酸铵 2.46 g/L，磷酸二氢钾0.86 g/L，磷酸氢二钾 1.11 g/L，硫酸钠 1.72 g/L，亮氨酸3.00 g/L，蒸馏水1 L，pH 值7.2~7.6；（2）DHIS（3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯）的分离与纯化将步骤（1）中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体，收集上清液，向上清液中加入5%的大孔树脂吸附4 h后将大孔树脂取出放置在30°C 烘箱中充分烘干，烘干后用甲醇浸泡3‑4次，将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏，浸膏用甲醇：水 = 1：1的溶液再次溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏；将二氯甲烷浸膏用正相硅胶柱(350 mm × 30 mm i.d.)分离纯化，依次用V (石油醚) ：V (乙酸乙酯) = (100:5、 100:10、100:20、100:30、100:40 和 0:100 ) 梯度洗脱，每个梯度3 L，得到5个组分（A1‑A5）；然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析，Sephadex LH‑20凝胶柱层析制备得到；（3）DHIS（3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯）的结构鉴定将步骤（2）中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5‑二羟基‑4‑异丙基‑二苯乙烯的结构。...

【技术特征摘要】
1.具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：包括以下步骤：（1）制备发光杆菌发酵液所述发光杆菌保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期为：2018年10月10日；保藏编号为：CCTCCNO：M2018664，分类命名为：Photorhabdustemperatasubsp.cinereaSN35；所述发光杆菌经NBTA培养基活化，将蓝色单菌落接种于液体LB培养基中获得种子发酵液，再转接于改良M发酵培养基中，放置在180r/min、28°C的恒温摇床上培养120h得到发光杆菌发酵液；所述改良M培养基的配方为：蛋白胨为15-35g/L，氯化钠为1-5g/L，葡萄糖6.13g/L，硫酸镁1.50g/L，硫酸铵2.46g/L，磷酸二氢钾0.86g/L，磷酸氢二钾1.11g/L，硫酸钠1.72g/L，亮氨酸3.00g/L，蒸馏水1L，pH值7.2~7.6；（2）DHIS（3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯）的分离与纯化将步骤（1）中得到的发光杆菌发酵液在室温下离心除去菌体，收集上清液，向上清液中加入5%的大孔树脂吸附4h后将大孔树脂取出放置在30°C烘箱中充分烘干，烘干后用甲醇浸泡3-4次，将收集的甲醇液减压浓缩得到发光杆菌的甲醇浸膏，浸膏用甲醇：水=1：1的溶液再次溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取3次，收集二氯甲烷相并减压浓缩得到二氯甲烷浸膏；将二氯甲烷浸膏用正相硅胶柱(350mm×30mmi.d.)分离纯化，依次用V(石油醚)：V(乙酸乙酯)=(100:5、100:10、100:20、100:30、100:40和0:100)梯度洗脱，每个梯度3L，得到5个组分（A1-A5）；然后将第三个组分多次经过正相硅胶柱层析，SephadexLH-20凝胶柱层析制备得到；（3）DHIS（3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯）的结构鉴定将步骤（2）中得到的物质通过NMR或MS鉴定所得3,5-二羟基-4-异丙基-二苯乙烯的结构。2.根据权利要求1所述的具有抗灰葡萄孢菌活性的DHIS的制备方法，其特征是：所述改良M培养基配方为：葡萄糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：于志国，王保娟，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21