作为用于分子识别酵母和真菌种类的目标基因的Ａｃｅ２制造技术

本发明专利技术涉及用于识别一种或更多种酵母种类的核酸引物和探针。更具体而言，本发明专利技术涉及Ａｃｅ２基因、相应的ＲＮＡ、特异性探针、引物和与其有关的寡核苷酸，以及它们在检测和／或区分酵母种类的诊断分析中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为用于分子识别酵母和真菌种类的目标基因的Ace2专利
本专利技术涉及用于识别一种或更多种酵母种类(species)的核酸引物和探针。更具体而言，本专利技术涉及Ace2基因、相应的RNA、特异性探针、引物和与其有关的寡核苷酸，以及它们在检测和/或区分酵母种类的诊断检测中的应用。专利技术背景酵母和真菌感染代表了免疫妥协患者发病率和死亡率的主要原因。处于酵母和真菌感染风险中的免疫妥协患者每年持续增加，这如同引起疾病的真菌和酵母因子的范围每年持续增加一样。由真菌感染、尤其是侵袭性真菌感染引起的死亡率在某些风险群体中是30％或更高。可用的抗真菌剂的阵容在增长；然而，对固有的和新出现的抗真菌药物抗性的识别也在增长。这些因素促成了在实验室检测中进行经费控制的增加需求，并已经导致检测程序中的实验室合并(laboratoryconsolidation)。侵袭性真菌感染正在增加。在2003年，估计有900万的风险患者，其中120万发生感染。念珠菌属菌种(假丝酵母属菌种，Candidaspp.)现被列为感染免疫抑制患者的最主要病原体。尤其地，在泌尿道、呼吸系统和血流中，在插入支架、导管和整形外科接头的部位处，感染是常见的。约10％的已知念珠菌属菌种已经牵涉到人类感染。当念珠菌进入血流时发生侵袭性念珠菌病，并且，估计其在美国以8/100,000人口的频率发生，死亡率为40％。白色念珠菌(Candidaalbicans)是血流感染的第四种最常见的原因。新出现的真菌病因子包括：镰刀菌属(Fusarium)、丝孢菌属(Scedosporium)、接合菌(Zygomycetes)和毛孢子菌菌种(Trichosporonspp.)(“StakeholderInsight：Invasivefungalinfections(侵袭性真菌感染)”，Datamonitor，Jan2004)免疫妥协患者，包括移植患者和手术患者、新生儿、癌症患者、糖尿病患者和那些患有HIV/AIDs的患者处于发生侵袭性真菌感染的高风险中(Datamonitorreport：Stakeholderopinion-Invasivefungalinfections，optionsoutweighreplacements(侵袭性真菌感染，选择重于取代)2004)。每年有大量严重的脓毒症病例被报道。尽管其医学管理有所改进，但脓毒症仍是重症特别护理医学中最大的挑战之一。引起脓毒症的微生物(细菌、真菌和酵母)传统地借助差灵敏性(25-82％)的微生物学培养方法在医院化验室中检测，其非常耗费时间，通常要花费2到5天来完成，并且花费多达8天来诊断真菌感染。由酵母或真菌引起的感染的确诊通常是基于从临床样本中回收并识别特定因子，或者显微镜证明具有独特形态学特征的真菌或酵母。然而，存在这些方法不能提供关于感染因子的结论性证据的众多情况。在这些情况中，可以应用特异性宿主抗体反应的检测，尽管这可再次被患者的免疫状态所影响。在检测并识别通常由细菌、酵母或真菌引起的血流感染中，时间是关键性的。有效处理取决于迅速有效地找到感染源并就抗生素或抗真菌剂做出正确的决定。基于真菌和酵母核酸的诊断主要集中于核糖体RNA(rRNA)基因、RNA转录物及其相关的DNA/RNA区域。rRNA基因在所有真菌种类中高度保守，并且它们也含有分歧的和独特的基因间转录间隔区。核糖体rRNA包含3个基因：大亚单位基因(28S)、小亚单位基因(18S)和5.8S基因。28S和18SrRNA基因被5.8SrRNA和两个内转录间隔区(ITS1和ITS2)分开。由于ITS区域含有多数的序列多态性，许多研究者已经将他们的努力集中于此作为目标(AtkinsandClark，2004)。rRNA基因也是多拷贝基因，在真菌基因组中大于10个拷贝。许多团队从事于开发真菌和酵母感染的新分析。US2004044193涉及白色念珠菌的转录因子CaTEC1；其抑制剂，以及诊断和治疗与念珠菌属感染相关的疾病的方法；也涉及含有核酸序列、蛋白质、宿主细胞和/或抗体的诊断和药物组合物，和许多其它方面。WO0183824涉及杂交分析探针和附属寡核苷酸(accessoryoligonucleotides)，用于检测来自白色念珠菌和/或都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)的核糖体核酸。US6017699和US5426026涉及一组DNA引物，其可以用于扩增并形成(speciate)5个医学上重要的念珠菌属种类的DNA。US6747137公开了有助于诊断念珠菌属感染的序列。EP0422872和US5658726公开了基于18SrRNA基因的探针，而US5958693公开了基于28SrRNA的探针，用于诊断一系列酵母和真菌种类。US6017366描述了基于几丁质合酶基因的序列，用于一系列念珠菌属种类的基于核酸的诊断学。但是清楚的是，需要开发更快、更精确的诊断方法，尤其是鉴于由现代抗微生物剂治疗引起的选择压力，所述抗微生物剂治疗产生具有突变基因组序列的抗性有毒菌株的增加群体。能早期诊断感染的微生物病因的方法使得能够选择特定狭窄范围的抗生素或抗真菌剂来治疗该感染(Datamonitorreport：Stakeholderopinion-Invasivefungalinfections，optionsoutweighreplacements(侵袭性真菌感染，选择重于取代)，2004；Datamonitorreport：StakeholderOpinion-Sepsis，underreactiontoanoverreaction(脓毒症，反应不足到过度反应)，2006)。只有在病原体被正确识别后，才能开始使用特异性抗生素或抗真菌剂的靶向治疗。许多医师希望看到用于酵母和真菌早期诊断的更好的体外扩增和直接检测诊断技术的发展(“StakeholderInsight：Invasivefungalinfections(侵袭性真菌感染)”，Datamonitor，Jan2004)。本专利技术提供了应用于核酸诊断(NAD)检测的新的真菌和酵母核酸目标。这些是临床有意义的细菌和真菌病原体的快速、精确的诊断检测，用于临床部门中的生物分析应用。Ace2是一种DNA结合的、细胞周期调控的转录因子。Ace2类似于转录因子SW15起作用，然而它们激活不同的基因。被翻译的Ace2蛋白存在于细胞周期早G1期中的细胞核中，并因而特异地激活G1期中基因的表达。尤其地，它激活CTS1基因。CTS1是几丁质酶编码基因，该基因在胞质分裂中被需要以降解母细胞和子细胞之间的细胞壁。在NCBIGenBank数据库中可公开获得7条Ace2序列，包括5个念珠菌属菌种序列。曲霉属菌种(Aspergillusspp.)没有可公开获得的Ace2序列。本专利技术人已经设计了PCR引物以在念珠菌属菌种中扩增与白色念珠菌中碱基对位置1736到2197相当的Ace2区域。Ace2基因的所述区域对于分子识别和/或区分酵母种类有用途。定义“合成寡核苷酸”指不直接来自基因组DNA或活的生物的2个或更多个核苷酸碱基的核酸聚合物分子。术语合成寡核苷酸拟包含已经用化学方法制造的或在体外酶合成的DNA、RNA和DNA/RNA杂交分子。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．酵母或真菌种类的诊断试剂盒，所述试剂盒含有能够与至少部分Ａｃｅ２基因或其相应ｍＲＮＡ结合的寡核苷酸探针。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】IE2008/04862008年6月13日1.探针在制备用于区分白色念珠菌(C.albicans)与其它念珠菌、酵母、真菌种类的试剂盒中的应用，其中所述探针用于白色念珠菌Ace2基因从碱基对位置1736到碱基对位置2197的基因区域的一部分，所述探针与选自SEQIDNOs：4-7和32-39的所述Ace2基因序列的一部分或其相应mRNA优先杂交，并且所述探针选自SEQIDNOs：3、30、31。2.权利要求1所述的应用，其中所述探针序列为SEQIDNO：30。3.任一前述权利要求中所述的应用，其中所述试剂盒还包含用于扩增至少部分所述Ace2基因的引物。4.权利要求3所述的应用，其中所述试剂盒包含用于部分所述Ace2基因的正向和反向引物。5.权利要求4所述的应用，其中所述试剂盒包含至少一种正向体外扩增引物和至少一种反向体外扩增引物，所述正向扩增引物选自SEQIDNOs：1、20-24，和也可以充当正向扩增引物的与其实质上相似或互补的序列，以及所述反向扩增引物选自SEQIDNOs：2、25-29，和也可以充当反向扩增引物的与其实质上相似或互补的序列。6.权利要求5所述的应用，其中所述正向引物序列选自SEQIDNOs：21、22和23，以及所述反向引物序列选自SEQIDNOs：27、28和29。7.权利要求1所述的应用，其中所述试剂盒基于直接核酸检测技术、信号扩增核酸检测技术，并且所述信号扩增核酸检测技术选自下列一种或更多种：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·G·巴里，
申请(专利权)人：爱尔兰国立高威大学，
类型：发明
国别省市：IE