利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法技术

本发明专利技术涉及利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法，在本发明专利技术的葡萄素的情况下，众所周知，上述葡萄素对肝脏保护、抗癌、抗氧化及皮肤的美白起到作用，而且对低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化以及血管平滑肌细胞的增殖和迁移具有阻碍作用。因此，本发明专利技术有效用于从来自葡萄植物的花药组织的愈伤组织中大量生产有用物质(二苯乙烯化合物)，尤其是葡萄素的方法，这对相关产业非常重要。

A Method of Mass Production of Vitamin from Cell Culture of Grape Vine Tissue by Stevioside

The present invention relates to a method for mass production of vitamin from cell culture of grape vine tissue by stevioside. In the case of the present invention, it is well known that the above-mentioned vitamin plays an important role in liver protection, anti-cancer, anti-oxidation and skin whitening, as well as in oxidation of low density lipoprotein and high density lipoprotein and proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Obstacles. Therefore, the present invention can be effectively used to produce useful substances (stilbene compounds) in large quantities from the callus of anther tissue of grape plants, especially grape element, which is very important for related industries.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法
本专利技术涉及利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法。
技术介绍
主要以白藜芦醇化合物来显示的二苯乙烯是来自由苯基丙氨酸开始的普通苯丙烷途径的一小类植物的次级代谢产物。白藜芦醇(resveratrol；3，4'，5-transtrihydroxystilbene)是如葡萄、花生及莓类等的一部分植物在应对如紫外线照射或真菌感染等的环境压力时产生的一种自然产生的植物抗毒素(phytoalexin)。白藜芦醇及其衍生物不仅在植物防御反应中作为植物抗毒素及抗氧化物质起到重要作用，而且具有多种有益特性，如抗癌效果、抗炎效果、抗肿瘤活性及抗衰老效果等。然而，像这样，具有如抗癌、抗氧化活性等的效果的白藜芦醇是已被确定其潜力的有前途的天然功能性资源，今后可通过多种研究用作功能性食品原料及新药原料来所使用，但是，目前将韩国国内的葡萄品种作为对象，用于增加该物质的含量的培养生理学及生物技术方面的研究极少。在这方面，作为增加白藜芦醇的含量的方法，最近揭示了在已收获的葡萄上人工接种霜霉病(Plasmoparaviticola)菌株的方法(韩国公开专利第2003-21976号)、在已收获的葡萄上进行短波紫外线处理的方法(J.ArgicFoodChem.2002Oct23；50(22)：6322-9；W00200192)或用铝处理葡萄的方法(US6834398)等，但这些都是收获葡萄后的处理方法或者栽培葡萄时的简单处理方法。在韩国公开专利第2005-0089492号中公开了“使用环境因子生产高含量白藜芦醇的葡萄的方法”，在韩国公开专利第2003-0021976号中公开了“使来自葡萄的天然抗癌物质的白藜芦醇的含量得到增大的白藜芦醇强化葡萄及其生产方法”，但如本专利技术所述，目前还没有公开“利用甜菊苷从葡萄藤的组织的细胞培养中大量生产葡萄素的方法”。
技术实现思路
技术问题本专利技术是根据如上所述的要求而提出的，本专利技术人为了构筑从来自葡萄植物的花药组织的愈伤组织中大量生产有用物质(二苯乙烯化合物)，将葡萄藤的花药组织切片移植到添加有植物生长调节物质的MS固体培养基中之后进行培养并对愈伤组织进行诱导，并且在增殖培养基中对经过诱导的上述愈伤组织进行培养来使之增殖后，在包含茉莉酮酸甲酯作为活性诱导剂、包含甜菊苷作为助溶剂的液体培养基中对经过增殖的上述愈伤组织进行振荡培养，结果确认出：在烧瓶条件下没有产生白藜芦醇，仅产生了δ-葡萄素(δ-viniferin)(图3)，在满足扩大(scale-up)条件的生物反应器的条件下确认出：不仅对δ-葡萄素有效果而且对昂贵的ε-葡萄素的生产非常有效(图5)。并且，在经过增殖的上述愈伤组织培养的培养基中处理活性诱导剂及助溶剂(甜菊苷)之后，在烧瓶条件下进行静置培养之后，结果确认出：仅生产白藜芦醇而不生产葡萄素(图6A)，在进行振荡培养之后确认出：仅生产葡萄素而不生产白藜芦醇(图6B)。通过本专利技术确认出：可以大量生产二苯乙烯，尤其，通过本专利技术的将甜菊苷用作助溶剂使用的来自葡萄藤的组织的愈伤组织的培养方法，不仅对δ-葡萄素的生产有效而且对昂贵的ε-葡萄素的生产非常有效，从而完成了本专利技术。解决问题的手段为了解决上述技术问题，本专利技术提供从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加活性诱导剂及助溶剂来进行振荡培养。并且，本专利技术提供从葡萄藤的愈伤组织中大量生产葡萄素的组合物，包含茉莉酮酸甲酯(MeJA)及甜菊苷(stevioside)作为有效成分。并且，本专利技术提供从葡萄藤中大量生产白藜芦醇(resveratrol)的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加茉莉酮酸甲酯及甜菊苷来进行静置培养。专利技术的效果在本专利技术中，二苯乙烯具有如抗癌、抗病毒，抗炎、抗老化、抗氧化等的多种生理活性，因此用于保健功能食品、化妆品、药品、燃料及功能性牲畜饲料等，尤其在葡萄素的情况下，对肝脏保护、抗癌、抗氧化及皮肤的美白有效，而且对阻碍低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的氧化和血管平滑肌细胞的增殖和迁移有效。因此，本专利技术有效用于从来自葡萄植物的花药组织的愈伤组织中大量生产有用物质(二苯乙烯化合物)，尤其是葡萄素的方法，这对相关产业非常重要。附图说明图1为示出本专利技术的二苯乙烯类化合物的生成过程的图。从如酪氨酸、苯基丙氨酸等的氨基酸中产生对香豆酸(p-coumaricacid)，由4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate：CoAligase，4CL)产生香豆酰辅酶A。再次，将此用类固醇硫酸酯酶(steroidsulfatase，STS)转化为白藜芦醇并通过氧化酶发生氧化，进而两种白藜芦醇变成一种二聚体葡萄素。图2为示出经过葡萄的愈伤组织的细胞培养及活性诱导剂的处理的白藜芦醇生物合成的基因(STS、ROMT)的转录表达的分析结果的图。此时所使用的活性诱导剂为茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)、脱落酸(abscisicacid，ABA)、水杨酸(salicylicacid，SA)、乙烯利、鞭毛蛋白22(Flg22)、甲基紫精(methylviologen，MV)及壳聚糖。图3为示出为了比较当通过植物液体培养来大量生产有用代谢物时用作助溶剂来使用的甲基环糊精(Methyl-beta-cyclodextrin，CD-M)和甜菊苷的增容性以及物质生产效率，而在葡萄的愈伤组织的培养液中放入100μM的MeJA和50mM的CD-M(MJ+CD)或者100μM的MeJA和50mM的甜菊苷(MJ+Stevioside)并进行培养之后提取白藜芦醇及δ-葡萄素来进行高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)分析的结果的图。并且，仅使用100μM的MeJA(MJ)作为对照区，而未使用助溶剂。图4为示出在葡萄的愈伤组织的培养液中进行100μM的MeJA和50mM的CD-M的处理(a)或100μM的MeJA和50mM的甜菊苷(E95)的处理(b)之后，将对香豆酸(p-cou)及白藜芦醇(res)作为前体来确认根据助溶剂处理的生物转化差异的结果的图。图5为示出进行大量培养(生物反应器条件)并在其培养液中放入100μM的MeJA及50mM的甜菊苷并进行培养之后，提取培养液并用高效液相色谱法分析确认δ-葡萄素及ε-葡萄素的产生的结果的图。图6为示出用高效液相色谱法来确认通过本专利技术开发的白藜芦醇及δ-葡萄素的选择性生产方法来所生产的白藜芦醇(A)及δ-葡萄素(B)的生产结果的图。具体实施方式为了达到本专利技术的目的，本专利技术提供从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加活性诱导剂及助溶剂来进行振荡培养。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.14 KR 10-2016-00305101.一种从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，将葡萄藤的组织切片移植到愈伤组织诱导培养基中来对葡萄藤的愈伤组织进行诱导；步骤(b)，在增殖培养基中对经过诱导的上述葡萄藤的愈伤组织进行培养来使之增殖；以及步骤(c)，在经过增殖的上述愈伤组织中添加活性诱导剂及助溶剂来进行振荡培养。2.根据权利要求1所述的从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，其特征在于，上述步骤(c)中的活性诱导剂及助溶剂分别为茉莉酮酸甲酯及甜菊苷。3.根据权利要求2所述的从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，其特征在于，分别以50～350μM及40～60mM的浓度添加上述茉莉酮酸甲酯及上述甜菊苷。4.根据权利要求1所述的从葡萄藤中大量生产葡萄素的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：金且英，郑洧汀，金锡源，鲁文喆，柳永培，李雨松，郑在哲，
申请(专利权)人：韩国生命工学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国,KR