本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开了一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。本发明专利技术利用海滨木槿转录组数据库，选取10个候选内参基因，以10个候选内参基因序列为模板，设计实时荧光定量PCR特异引物，选取海滨木槿不同组织及各种非生物胁迫和激素处理下的海滨木槿叶片为实验材料进行荧光定量PCR实验，最后运用geNorm，NormFinder和BestKeeper软件进行数据分析，本发明专利技术专利中最稳定内参基因是ACT和SKIP。本发明专利技术方法建立了海滨木槿稳定内参基因的筛选体系，为开展海滨木槿基因功能研究提供了稳定内参基因。
【技术实现步骤摘要】
海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法
本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种适用于海滨木槿不同组织及各种非生物胁迫和激素处理下实时荧光定量PCR的内参基因的筛选方法。
技术介绍
在林木遗传育种中，基因表达模式探究普遍且重要。实时荧光定量PCR是基因表达模式研究中最常用的核酸定量技术，它具有更高的灵敏度，更好的特异性和更宽的检测范围。初始样品量，RNA完整性、cDNA合成效率等可能存在的一些差异，会影响实时荧光定量PCR结果的准确性。因此，筛选合适的内参基因是实时荧光定量PCR的重要前提条件。许多研究已经筛选出一些内参基因，如肌动蛋白（ACT），核糖体RNA（18SrRNA或28SrRNA）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。这些基因与基本细胞过程有关，如核糖体生物合成，糖酵解代谢，蛋白质折叠和细胞骨架构成等。然而，研究发现一些常用的内参基因在特定的植物物种、不同器官组织以及特定环境条件下的表达并不稳定。例如，18SrRNA在马铃薯块茎中表达不稳定，而对水稻来说却是合适的内参基因。因此，有必要为特定植物物种筛选适合的内参基因。为了筛选最合适的内参基因，已经开发出多种分析软件来评价内参基因表达的稳定性，如NormFinder，geNorm和BestKeeper。海滨木槿（HibiscushamaboSieb.etZucc）一般生长在沿海盐碱地的公共绿地，属于锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hamabo），是一种重要的半红树植物。因其具有优良的耐盐性，海滨木槿被认为是重盐土地生态修复的良好选择。当NaCl浓度达到1.1％~1.5％时，海滨木槿仍然可以保持正常生长状态，是研究木本植物耐盐机制的良好材料。然而，关于海滨木槿内参基因的鉴定工作还未有相关报道。本专利技术选择了10个候选内参基因，旨在找到一种海滨木槿开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参基因的筛选方法，为以后大规模开展基因特性及功能研究奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法。本专利技术所述的一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，按下列步骤进行：（1）利用海滨木槿转录组测序数据，挑选10个海滨木槿候选内参基因，并以挑选的10个海滨木槿序列为模板设计了10对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中10个内参基因的核苷酸序列及设计的10对实时荧光定量PCR引物序列为：海滨木槿（HibiscushamaboSieb.etZucc.）肌动蛋白（ACT）核苷酸序列为SEQIDNO.1。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物ACT-F：GGCACCTCTCAACCCCAAGG（SEQIDNO.2）反向引物ACT-R：GAGAGAACGGCCTGGATGGC（SEQIDNO.3）扩增长度：102bp；扩增效率（%）：94.5；线性关系：0.98海滨木槿小核RNAU6（U6）核苷酸序列为SEQIDNO.4。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物U6-F：ACCGGCGGTGGAGAAGAAGA（SEQIDNO.5）反向引物U6-R：ACGCACTTCAACCTGGCGAT（SEQIDNO.6）扩增长度：112bp；扩增效率（%）：95.1；线性关系：0.98海滨木槿延伸因子（EF1α）核苷酸序列为SEQIDNO.7。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物EF1α-F：AACCACCCAGGCCAAATCGG（SEQIDNO.8）反向引物EF1α-R：ACCATGGGCTTGCTGGGAAC（SEQIDNO.9）扩增长度：191bp；扩增效率（%）：94.1；线性关系：0.97海滨木核糖体RNA（18S）核苷酸序列为SEQIDNO.10。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物18S-F：GGTCGGATTTGGAACGGCGA（SEQIDNO.11）反向引物18S-R：CTCCACGGGCGTATCGAGG（SEQIDNO.12）扩增长度：106bp；扩增效率（%）：107.9；线性关系：1.03海滨木槿核糖体蛋白（S13）核苷酸序列为SEQIDNO.13。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物S13-F：GCCCATGGTCTTGCTCCTGA（SEQIDNO.14）反向引物S13-R：GTAATAGCGGGCAAGGCGGT（SEQIDNO.15）扩增长度：159bp；扩增效率（%）：93.7；线性关系：0.97海滨木槿微管蛋白（TUB）核苷酸序列为SEQIDNO.16。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物TUB-F：ATCGGTCAGGCCGGTATCCA（SEQIDNO.17）反向引物TUB-R：AGTCGGCTCCAGGTCCACAA（SEQIDNO.18）扩增长度：195bp；扩增效率（%）：105.4；线性关系：1.02海滨木槿泛素缀合酶E2（UBC）核苷酸序列为SEQIDNO.19。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物UBC-F：TCCTGCGAGGAAGAGGCTGAT（SEQIDNO.20）反向引物UBC-R：GGGTGTCATCCGGCCCAAAT（SEQIDNO.21）扩增长度：131bp；扩增效率（%）：103.6；线性关系：1.02海滨木槿组蛋白（HIS）核苷酸序列为SEQIDNO.22。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物HIS-F：GCTACCAAGGCTGCCCGAAA（SEQIDNO.23）反向引物HIS-R：AGCATGGCTCTGGAAACGCA（SEQIDNO.24）扩增长度：204bp；扩增效率（%）：99.8；线性关系：0.97海滨木槿甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）核苷酸序列为SEQIDNO.25。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物GAPDH-F：GGAGAGGTGGTAGGGCTGCT（SEQIDNO.26）反向引物GAPDH-R：CGTCGACAGTGGGAACACGG（SEQIDNO.27）扩增长度：132bp；扩增效率（%）：93.5；线性关系：0.97海滨木槿Ski相关蛋白（SKIP）核苷酸序列为SEQIDNO.28。实时荧光定量PCR引物序列：正向引物SKIP-F：TGAAGATGTGCCTCCACGCC（SEQIDNO.29）反向引物SKIP-R：AGAGGGCAACTGCGACCAAT（SEQIDNO.30）扩增长度：265bp；扩增效率（%）：108.6；线性关系：1.04（2）分别选取干旱，高盐，低温，高温，脱落酸，水杨酸，茉莉酸甲酯共7种处理后0、1、6、12、24和48h的海滨木槿幼苗的叶片组织以及嫩根、老叶，嫩叶，花托，花瓣，雄蕊共6种器官组织为实验材料，进行实时荧光定量实验；（3）将实时荧光定量PCR得到的数据导入三个常用的内参稳定性评价软件geNorm，NormFinder和BestKeeper进行内参稳定性和内参数目分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合。（4）步骤（1）中所述的内参基因为肌动蛋白（ACT），小核RNAU6（U6），延伸因子（EF1α），18S核糖体RNA（18S），核糖体蛋白（S13），微管蛋白（TUB），泛素缀合酶E2（UBC），组蛋白（HIS），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行：（1）利用海滨木槿转录组测序数居，挑选10个海滨木槿内参候选基因，并以挑选的10个海滨木槿序列为模板设计了10对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中10个内参基因的核苷酸序列及设计的10对实时荧光定量PCR引物序列为SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.30.（2）分别选取干旱、高盐、低温、高温、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯共7种处理叶片组织以及嫩根、老叶、嫩叶、花托、花瓣、雄蕊共6种器官组织为实验材料，进行实验.（3）将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm，NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合。
【技术特征摘要】
1.一种海滨木槿实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法，其特征在于按下列步骤进行：（1）利用海滨木槿转录组测序数居，挑选10个海滨木槿内参候选基因，并以挑选的10个海滨木槿序列为模板设计了10对实时荧光定量PCR的内参基因引物，其中10个内参基因的核苷酸序列及设计的10对实时荧光定量PCR引物序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.30.（2）分别选取干旱、高盐、低温、高温、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯共7种处理叶片组织以及嫩根、老叶、嫩叶、花托、花瓣、雄蕊共6种器官组织为实验材料，进行实验.（3）将实时荧光定量PCR得到的数据导入geNorm，NormFinder和BestKeeper软件进行分析，筛选出最优内参基因和内参基因组合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中所述的内参基因为肌动蛋白（ACT），小核RNAU6（U6），延伸因子（EF1α），18S核糖体RNA（18S），核糖体蛋白（S13），微管蛋白（TUB），泛素缀合酶E2（UBC），组蛋白（HIS），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），Ski相关蛋白（...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾春笋，王芝权，倪龙杰，刘凉琴，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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