用于高效生成瑞鲍迪苷的UDP依赖性糖基转移酶制造技术

本发明专利技术提供了用于改善宿主细胞中甜菊糖苷类化合物生成的组合物和方法。在一些实施方案，对所述宿主细胞进行遗传修饰以包含编码粟(Setaria italica)UDP‑糖基转移酶40087或其变体UDP‑糖基转移酶的异源性核苷酸序列。在一些实施方案，对所述宿主细胞进行遗传修饰以包含编码UDP‑糖基转移酶sr.UGT_9252778、Bd_UGT10850、和/或Ob_UGT91B1_like的异源性核苷酸序列。在一些实施方案，所述宿主细胞还包含一种或多种异源性核苷酸序列，所述异源性核苷酸序列编码能够在所述宿主细胞中生成甜菊糖苷类化合物的途径的其他酶。本发明专利技术所述的组合物和方法为所述异源生成甜菊糖苷类化合物(包括但不限于，瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)提供了有效途径。

UDP-dependent glycosyltransferase for efficient production of ribodin

The invention provides compositions and methods for improving the formation of stevioside compounds in host cells. In some implementations, the host cells are genetically modified to contain heterologous nucleotide sequences encoding UDP glycosyltransferase 40087 of Setaria italica or its variant UDP glycosyltransferase. In some implementations, the host cells are genetically modified to contain heterologous nucleotide sequences encoding UDP_glycosyltransferase sr.UGT_9252778, Bd_UGT 10850, and/or Ob_UGT 91B1_like. In some implementations, the host cell also contains one or more heterologous nucleotide sequences encoding other enzymes capable of generating stevioside compounds in the host cell. The composition and method of the invention provide an effective way for the heterogenous formation of stevioside compounds (including but not limited to, rebaudioside D and rebaudioside M).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于高效生成瑞鲍迪苷的UDP依赖性糖基转移酶1.相关申请的交叉引用本申请要求并享有于2016年8月12日提交的美国临时申请号62/374,408的优先权，其内容通过引用其整体并入本文。2.专利
本专利技术涉及某些尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)，包含所述尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的组合物，包含所述尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶的宿主细胞，以及它们用于生成瑞鲍迪苷(包括瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的方法。3.专利技术背景需要源自天然来源的零热量甜味剂来限制高糖消耗(例如，糖尿病类和肥胖症)的不良影响。瑞鲍迪苷M(RebM)是由甜叶菊植物(SteviarebaudianaBertoni)生成的许多甜味化合物之一。在所有的瑞鲍迪苷中，RebM具有最高的效力(比蔗糖甜约200-300倍)，口感最纯净。然而，RebM仅由甜叶菊植物少量生成，并且仅占甜菊糖苷(steviolglycoside)总含量的一小部分(<1.0％)，Ohtaetal.,2010,J.Appl.Glycosci.,57,199-209(2010)。因此，希望使用生物技术途径来生成RebM，从而使其能够大量且高纯度地生成。为了使用生物技术经济地生成产品，从原料到产品的生物转化中的每个步骤需有利地具有高转化效率(理想地>90％)。在用于生成RebM的酵母工程中，在倒数第二个生物合成步骤中发现了限制，即瑞鲍迪苷A(RebA)向瑞鲍迪苷D(RebD)的转化，参见图1A。观察到天然酶(Ono，EP2826861A1，UGT91D_like3或近似同源物)将约3％的RebA转化为RebD。已鉴定了另外两种能够将RebA转化为RebD的UGT酶。其中一种是来自稻(Oryzasativa)的Os_UGT_91C1(在Houghton-Larsen等人的专利申请WO2013/022989A2中也被称为EUGT11)，另一种是来自番茄(Solanumlycopersicum)的Sl_UGT_101249881(在Markosyan等人的专利申请WO2014/193888A1中也被称为UGTSL2)。然而，本申请专利技术人最初观察到Os_UGT_91C1和S1_UGT_101249881均具有低于期望的转化效率，分别为约53％和70％。所有这三种酶，UGT91D_like3、Os_UGT_91C1和SL_UGT_101249881，均是尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)，其通过形成β(1->2)连接键将葡萄糖基团部分转移至19-O-葡萄糖残基的C-2'位置(图1A)。为了有效且高纯度地生成RebM，需要能够以高效率将RebA转化为RebD的改进的酶。本专利技术提供的组合物和方法解决了此种需求，并且还提供了相关优点。4.专利技术概述本专利技术提供了改善的将RebA转化为RebD和改善的RebD和/或RebM生成量的组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于某些尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶(UGT)的惊人发现，所述尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶能够以非常高的效率将RebA转化为RebD。假设市场对RebM的需求为每年50亿吨，即使使用新的UGT进行应变性能的适度改进(例如改进10％)，则也可能在未来节省超过一千万美元的生产成本。本专利技术所述的某些UGT还能够生成具有很少或不含非天然糖苷类化合物(例如，RebM2副产物，即RebM的异构体)的RebM。参见CeunenS.etal.SteviolGlycosides:ChemicalDiversity,Metabolism,andFunction.J.Nat.Prod.,76,1201-1228(2013)，可获悉目前已知的甜菊糖苷类化合物列表。因此，在某些实施方案，本专利技术所述的组合物和方法可降低下游加工成本，以得到含有高纯度RebM的组合物。本专利技术还提供了用于替代酶的组合物和方法，所述替代酶能够生成具有与先前已知的UGT不同的底物特异性的甜菊糖苷类化合物。与由其他已知酶类生成的那些相比，所述新的替代酶可潜在地生成不同混合物或不同比例的甜菊糖苷类化合物。具有不同混合物或不同比例的甜菊糖苷类化合物的组合物可潜在地赋予替代的甜味特征，其可用于配制各种消费品或食品。因此，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞及其用于生成工业上有用的化合物的方法。一方面，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含：编码UDP-糖基转移酶(UGT40087，也称为Si_UGT_40087)的异源性核酸。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞还包含能够生成甜菊醇和/或甜菊糖苷类化合物的一种或多种酶途径。在一些实施方案，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与UGT40087的序列(例如，SEQIDNO：1或SEQIDNO：11)具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞能够以大于90％、95％、96％、或97％的效率将RebA转化为RebD。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞包含UDP-糖基转移酶，所述UDP-糖基转移酶包含糖受体结构域，其中所述糖受体结构域的所述氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的糖受体结构域的氨基酸序列具有至少84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞包含UDP-糖基转移酶，所述UDP-糖基转移酶包含loop1氨基酸序列，变体loop1氨基酸序列，loop2氨基酸序列，变体loop2氨基酸序列，loop3_1氨基酸序列，变体loop3_1氨基酸序列，loop3_2氨基酸序列，变体loop3_2氨基酸序列，loop4_1氨基酸序列，变体loop4_1氨基酸序列，loop4_2氨基酸序列，或其任何组合。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞包含UDP-糖基转移酶，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述糖受体结构域具有至少61％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和进一步包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述loop4_1氨基酸序列。在一些实施方案，本专利技术提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：2、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的序列具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞能够以大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、或97％的效率将RebA转化为RebD。在一些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞包含UDP-糖基转移酶，所述UDP-糖基转移酶包含糖受体结构域，其中所述糖受体结构域的所述氨基酸序列与SEQIDNO：2、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的所述糖受体结构域的所述氨基酸序列具有至少84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP‑糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP‑糖基转移酶包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：11具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.08.12 US 62/3744081.经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的经遗传修饰的宿主细胞，其能够以大于90％、95％、96％、或97％的效率将RebA转化为RebD。3.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的序列的氨基酸序列。4.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶能够对甜菊糖苷的19-O-葡萄糖的C2’位置进行β-1,2糖基化。5.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶由异源性核酸编码，其中所述异源性核酸包含与SEQIDNO：13具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的核苷酸序列。6.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶由具有SEQIDNO：13的序列的异源性核酸编码。7.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其能够以大于90％、95％、96％、或97％的效率将RebA转化为RebD，和其中所述UDP-糖基转移酶包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11具有至少95％序列同一性。8.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶是具有功能结构域的多肽，所述功能结构域与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的功能结构域具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性。9.根据权利要求8所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述功能结构域是糖受体结构域。10.根据权利要求9所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述糖受体结构域位于所述UDP-糖基转移酶的N-末端。11.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的糖受体结构域。12.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含糖受体结构域，其中所述糖受体结构域的氨基酸序列与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的糖受体结构域的氨基酸序列具有至少84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。13.根据权利要求12所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含：(a)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop1位置的所述UDP-糖基转移酶的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop1氨基酸序列、SEQIDNO：28的序列、或变体loop1氨基酸序列；(b)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop2位置的所述UDP-糖基转移酶的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop2氨基酸序列、或变体loop2氨基酸序列；(c)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop3_1位置的所述UDP-糖基转移酶的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop3_1氨基酸序列、或变体loop3_1氨基酸序列；(d)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop3_2位置的所述UDP-糖基转移酶的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop3_2氨基酸序列、或变体loop3_2氨基酸序列；(e)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop4_1位置的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop4_1氨基酸序列、或变体loop4_1氨基酸序列；(f)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop4_2位置的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的loop4_2氨基酸序列；或(g)(a)至(f)的任何组合。14.根据权利要求13所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述变体loop1氨基酸序列，所述变体loop2氨基酸序列，所述变体loop3_1氨基酸序列，所述变体loop3_2氨基酸序列，和所述变体loop4_1氨基酸序列中的任一个均从它们各自的、不同于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的另一UDP-糖基转移酶的相应环路(loop)位置得到，其中所述另一UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。15.根据权利要求14所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述另一UDP-糖基转移酶能够对甜菊糖苷的所述19-O-葡萄糖的所述C2’位置进行β-1,2糖基化。16.根据权利要求15所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述另一UDP-糖基转移酶是Os_UGT_91C1。17.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含：(a)所述另一UDP-糖基转移酶的糖受体结构域，所述另一UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述糖受体结构域具有至少61％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列；和(b)位于分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述loop4_1位置的另一UDP-糖基转移酶的位置处的SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述loop4_1氨基酸序列。18.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含作为所述糖受体结构域的SEQIDNO：22的序列。19.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列，和在分别对应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述loop4_1位置的位置处具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的所述loop4_1氨基酸序列。20.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含SEQIDNO：25的序列。21.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含一个或多个以下氨基酸残基：(a)缬氨酸，所述缬氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置11的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；(b)异亮氨酸，所述异亮氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置12的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；(c)脯氨酸，所述脯氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置55的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；(d)谷氨酸，所述谷氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置90的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；(e)丝氨酸，所述丝氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置203的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；(f)谷氨酸，所述谷氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置223的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处；或(g)缬氨酸，所述缬氨酸位于对应于SEQIDNO：11的氨基酸位置413的所述UDP-糖基转移酶的氨基酸位置处，其中，对应于SEQIDNO：11的所述氨基酸位置的所述UDP-糖基转移酶的所述氨基酸位置均通过序列比对进行确定。22.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有SEQIDNO：24的氨基酸序列。23.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含糖供体结构域，其中所述糖供体结构域包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11的糖供体结构域的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。24.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述糖供体结构域位于所述UDP-糖基转移酶的C-末端。25.根据前述权利要求任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：1或SEQIDNO：11具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。26.经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：2具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。27.根据权利要求26所述的经遗传修饰的宿主细胞，其能够以大于50％的效率将RebA转化为RebD。28.根据权利要求26或27所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶是具有SEQIDNO：2的序列的多肽。29.根据权利要求26-28任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶是包含功能结构域的多肽，所述功能结构域与SEQIDNO：2的功能结构域具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性。30.经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：5具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。31.根据权利要求30所述的经遗传修饰的宿主细胞，其能够以大于40％的效率将RebA转化为RebD。32.根据权利要求30或31所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有SEQIDNO：5的序列的氨基酸序列。33.根据权利要求30-32任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有功能结构域的多肽，所述功能结构域与SEQIDNO：5的功能结构域具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性。34.经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码UDP-糖基转移酶的异源性核酸，所述UDP-糖基转移酶包含与SEQIDNO：6具有至少85％、90％、或95％序列同一性的氨基酸序列。35.根据权利要求34所述的经遗传修饰的宿主细胞，其能够以大于85％或90％的效率将RebA转化为RebD。36.根据权利要求34或35所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有SEQIDNO：6的序列的多肽。37.根据权利要求34-36任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述UDP-糖基转移酶包含具有功能结构域的多肽，所述功能结构域与SEQIDNO：6的功能结构域具有至少80％、85％、90％、或95％序列同一性。38.根据权利要求29、33和37任一项所述的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述功能结构域是糖受体结构域。39.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立山，李文宗，G维施曼，A坎科耶，C加西亚德根扎罗，T马哈德奎美亚道斯，S杰克逊，M利威尔，D普拉特，
申请(专利权)人：阿迈瑞斯公司，
类型：发明
国别省市：美国,US